COⅠ基因微条形码技术在毛发种属鉴定中的应用

夏皙，丁梅

（中国医科大学法医学院，辽宁沈阳 110000）

COⅠ基因微条形码技术在毛发种属鉴定中的应用

夏皙，丁梅

（中国医科大学法医学院，辽宁沈阳 110000）

目的利用COⅠ基因微条形码技术对哺乳动物毛发进行种属鉴定。方法设计一对哺乳动物COⅠ基因微条形码通用引物，利用共同区PCR技术对来自于哺乳纲5个目11个种属的实验动物毛发DNA进行扩增，并对扩增产物进行双向引物测序，将测序结果进行拼接后所得的基因序列输入BOLD数据库进行同源性比对。结果本研究设计的微条形码通用引物能够对所有种属实验动物毛发DNA进行扩增，扩增片段长度147bp。数据库同源比对结果显示最匹配物种与实验动物种属相符，除狮同源匹配度为98.99%外，其他实验动物同源匹配度均为100%，且狮种内遗传距离1%，种间遗传距离大于种内遗传距离十倍，可以进行种属判定。结论建立的COⅠ基因微条形码技术能够快速准确地对哺乳动物毛发检材进行种属鉴定。

法医遗传学；毛发；种属鉴定；COⅠ基因微条形码

种属鉴定是法医物证鉴定的重要内容之一，能够为案件的侦破提供线索和依据。毛发作为一种特殊的生物检材，具有易获取、无创、耐腐蚀、不易腐败的特点。动物和人类关系密切，因此在日常案件侦查中，动物毛发成为常见的微量物证之一，尤其是在由于非法野生动物交易造成的日益严重的物种多样性危机的背景下，调查人员需要一种能够快速、准确鉴定毛发种属的方法。

COⅠ基因5′端650 bp DNA序列的碱基组合可保证每一个物种都有唯一的DNA条形码基因，其DNA序列稳定，很少存在插入和缺失，是目前用于动物分类与鉴别的最理想DNA条形码[1]。毛发检材由于其自身角化，DNA高度降解，无法提取出完整的条形码基因，因此本研究利用一对微条形码通用引物扩增哺乳动物纲5个目11个种属动物的COⅠ基因片段（147 bp），通过对PCR产物测序的方法进行种属鉴定，以达到快速、准确鉴定毛发种属的目的。

1 材料与方法

1.1 实验样本与DNA提取

采集灵长目动物（人）、兔形目动物（兔）、偶蹄目动物（牛、羊）、奇蹄目动物（马、驴）、食肉目动物（犬、狐、虎、狮、熊）共11种动物的毛发样本，其中，虎、狮、熊毛发各1例，来自沈阳森林野生动物园，其他动物毛发各5例，分别来自志愿者（人）、养殖场（兔、牛、羊、马、驴、狐）、宠物医院（犬）。

DNA提取具体步骤如下：向装有样品的离心管中加入5%Chelex-100 91μL，蛋白酶（10mg/mL）5μL，1mol DTT 4μL，56℃金属浴3h，剧烈振荡10s，100℃金属浴8min，剧烈振荡10s，12000×g离心5min。取上清液30μL与300μL MA缓冲液及磁珠10 μL混匀，置于磁力架上2 min，弃去上清液，加入700 μL MLW缓冲液，振荡混匀静置于磁力架上，待磁珠完全吸附后弃去上清液，加入70%乙醇溶液700 μL洗涤2次，振荡混匀，磁力架上静置，弃去上清液。开盖15min将乙醇彻底挥干，加入TE缓冲液20μL，65℃8 min，磁力架上静置，转移液体至新的离心管中，于4℃保存备用。

1.2 引物设计与合成

设计哺乳动物COⅠ基因微条形码通用引物。根据从GeneBank上获取的实验动物及其近缘物种已知的DNA条形码序列，通过DNAMAN软件进行序列比对，并应用Primer Premier 5.0软件完成引物设计，委托宝生物工程（大连）有限公司合成。上游引物5′-CTGCCCATGCCTTTGTGATAATCTT-3′，下游引物5′-ATGGTGGAAGCAGTCAGAAGCT-3′。

1.3 PCR扩增

扩增体系总体积为20μL，其中含有10×PCR缓冲液2 μL、rTaq聚合酶1 U、dNTP Mix 1.5 μL、上下游引物各5μmol及模板100ng。用TP600型梯度PCR仪（日本TaKaRa公司）进行扩增。PCR反应条件：94℃5 min；94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，循环35次；72℃5min。

1.4 PCR产物检测

1.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，0.1% GeneFinder染色，利用凝胶成像系统观察电泳谱带。

1.4.2 DNA测序

利用3730xl基因分析仪（美国AB公司）对11种实验动物COⅠ基因扩增产物采用循环测序法进行双向测序，测得序列用Chromas软件读取结果。

1.5 结果分析

1.5.1 同源性比对

将实验结果所得COⅠ基因扩增产物序列输入BOLD数据库上进行同源性比对。查看相似度最高的动物是否与本实验动物种属来源一致，并根据最高匹配度判断样本种属与最匹配动物亲缘关系远近。同种内动物同源性较高，均在96%以上；隶属同一科不同属的物种其DNA同源性在70%～90%；而分属不同科的物种同源性较低，65%～70%[1]。

1.5.2 遗传距离计算

用MEGA 5.0中Kimura双参数法计算COⅠ基因DNA测序结果和标准条形码序列种内和种间遗传距离。遗传距离根据“十倍原则”[2]（变异率小于1%为同一物种，种间距离是种内距离10倍以上）确定样本种属。

2 结果

2.1 通用引物扩增有效性检测

用通用引物扩增本研究包括灵长目、兔形目、偶蹄目、奇蹄目、食肉目在内的11种实验动物的DNA模板，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1所示，所有种属动物DNA模板均能成功扩增，产物片段长度147bp。

2.2 DNA测序结果

每种扩增产物均能得到清楚的序列图谱，用Clutsal X、MEGA 5.0软件进行序列比对。结果显示，11个物种均存在碱基差异，差异位点的位置如图2所示。

2.3 同源性比对结果

将本研究所得COⅠ基因扩增产物序列结果录入BOLD数据库进行同源性比对，结果显示，各样本与各种近缘种属动物同源匹配度中除狮为98.99%外，其他动物均为100%（表1）。

2.4 遗传距离分析结果

各种动物的扩增产物序列结果和数据库中近缘物种数据比对后的遗传距离见表2。结果显示，种内遗传距离中狮种内遗传距离为1%，其他动物种内遗传距离均小于1%，食肉目动物种间平均遗传距离为18.7%，种间遗传距离为种内10倍以上，存在明显的条形码间隙。进一步计算实验动物狮COⅠ基因序列与数据库中亚洲狮、非洲狮的遗传距离，分别为1%、 4.2%。

表1 实验动物COⅠ基因扩增产物序列同源性比对结果

表2 实验动物和数据库中近缘种属动物的遗传距离

3 讨论

COⅠ基因全长1659bp，条形码基因包括一段从COⅠ基因5′端开始的648bp长的序列[3]，片段序列高度保守，已有适合几乎所有后生动物的通用引物，而且条形码序列有着丰富的变异位点，在绝大多数物种中有明显的条形码间隙[4]。本研究对毛发进行种属鉴定，毛发检材由于自身角化，DNA经历高度降解而无法提取出完整的COⅠ基因，需要检测更短的目的片段，而有研究[5]显示，全长DNA条形码鉴别准确度最高，为97%，而5′端100 bp的区域鉴别度为90%，250 bp区域为95%。

由于微条形码序列引物扩增片段较短，在一定程度上限制了通用引物的设计，而不同于生物分类学，DNA条形码技术在法医领域中的应用多为对未知检材的鉴定，因此微条形码技术在法医鉴定中多采用PCR复合扩增的方法，通过几对引物复合扩增以获得目的基因序列。由于检索数据库亦未能查到可扩增全部实验动物样本的微条形码引物，因此本研究拟设计覆盖更多种属（目、科、属、种）哺乳动物的COⅠ基因微条形码引物，为适应法医学降解检材的需要，要求扩增产物片段长度在150bp左右。因此，本研究设计了扩增片段长度为147 bp的微条形码通用引物，结果表明该COⅠ基因通用引物能够实现所有实验动物COⅠ基因的扩增。

将11种实验动物COⅠ基因测序结果在BOLD数据库进行同源性比对，比对结果表明，除狮同源匹配度为98.99%外，其他实验动物均为100%，可初步判断种属来源。当同源性比对不能确定种属来源时，可通过计算遗传距离，并根据“十倍原则”[2]进行种属鉴定。结果显示，除狮的种内遗传距离为1%外，其他动物种内遗传距离均小于1%，食肉目动物种间平均遗传距离为18.7%，种间遗传距离大于种内遗传距离10倍，可以进行种属认定。

实验动物狮与数据库信息同源匹配度未达100%（98.99%），进一步计算其COⅠ基因序列与数据库中亚洲狮、非洲狮的遗传距离，分别为1%、4.2%，根据“十倍原则”，可以认定其为亚洲狮。

有研究[6]表明，同一物种种内差异较小，一般小于1%，很少大于2%，而种间差异多大于10%，有时种内检测到较高变异，一方面可能由于被检个体来源于不同地理隔离的种群，遗传距离较远，另一方面线粒体为母系遗传，存在品种杂交等人为干预时，也可能出现遗传距离变大的情况。因此条形码数据库需包括同一种属不同地域足够个体数量的条形码序列以确保种内遗传距离不被低估。

本研究结果提示，本实验设计的哺乳动物COⅠ基因微条形码引物能够用于准确鉴定物种，对野生动物保护及毛皮制品鉴定具有一定应用价值。

[1]Wang ZD，Guo YS，Liu XM，et al.DNA barcoding South China Sea fishes[J].Mitochondr Dna，2012，23（5）：405-410.

[2]Ribeiro AO，Caires RA，Mariguela TC，et al.DNA barcodes identify marine fishes of Sao Paulo State，Brazil[J].Mol Ecol Resour，2012，12（6）：1012-1020.

[3]Hebert P，Ratnasingham S，DeWaard J.Barcoding animal life：Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proc Biol Sci，2003，270（S1）：S96-S99.

[4]Ramadan HA.Sequence of specific mitochondrial 16S rRNA gene fragment from Egyptian buffalo is used as a pattern for discrimination between river buffaloes，cattle，sheep and goats[J].Mol Biol Rep，2011，38（6）：3929-3934.

[5]Meusnier I，Singer GA，Landry JF，et al.A universal DNA mini-barcode for biodiversity analysis[J].Bmc Genomics，2008，9：214.

[6]Avise JC，Walker D.Pleistocene phylogeographic effects on avian populations and the speciation process[J]. Proc Biol Sci，1998，265（1395）：457-463.

Application of COⅠGene Mini-barcoding in Species Identification of Hair

XIA Xi,DING Mei
（School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110000,China）

ObjectiveTo identify the species of mammalian hair using COⅠgene mini-barcoding technology.MethodsA pair of universal primers for mammalian COⅠgene mini-barcoding were designed. The hair DNA samples of experimental animals from 11 species in 5 orders,mammalia was amplified by PCR technology with universal primers,and the PCR products were sequenced by bi-directional DNA and after the sequences splicing the results were deposited into the BOLD database to perform the homology comparison.ResultsThe DNA of hair from all experiment animal species could be totally amplified by the mini-barcoding universal primers designed in this study.The length of amplified fragment was 147 bp.The result of homology comparison in the database showed that the closest matching species were consistent with the experiment animal species.In addition to the matching degree of Panthera leo（98.99%）,all homology matching degree of the other experiment animals were 100%,and the intraspecific genetic distance of Panthera leo was 1%.The interspecific genetic distance was ten times more than the intraspecific genetic distance which could be used for species identification.ConclusionThe COⅠgene mini-barcode technology is established and can provide fast and accurate species identification for hair of mammals.

forensic genetics;hair;species identification;COⅠgene mini-barcoding

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.012

1004-5619（2016）06-0441-03

2015-05-28）

（本文编辑：李成涛）

夏皙（1988—），女，主要从事法医遗传学研究；E-mail：765944359@qq.com

丁梅，女，教授，主要从事法医遗传学研究；E-mail：dingmei1209@qq.com