细胞联合生物支架治疗脊髓损伤的研究进展

孙成龙 黄立佳 黄杨 邹阳 王昌兴⋆

细胞联合生物支架治疗脊髓损伤的研究进展

孙成龙 黄立佳 黄杨 邹阳 王昌兴⋆

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的发生已成为全球性的医疗难题，现今国内外研究的重点及热点在于如何克服再生屏障，修复受损组织，促进脊髓再生。1987年正式提出组织工程学概念，其基本原理是将少量种子细胞体外培养扩增后，联合生物材料，修复损伤脊髓组织，改善生理功能。目前众多实验室研究也致力于联合生物支架与细胞，使其发挥互补协同作用，取长补短共同促进轴突再生和功能恢复。本文回顾了近年来以细胞载体为基础复合组织工程支架在SCI修复中的具体应用及其优势与局限性，旨在为进一步临床研究提供理论依据。

1 学术背景

SCI不仅可以造成感觉及运动障碍，而且可以导致多系统功能紊乱，包括心血管系统、呼吸系统、消化系统和泌尿生殖系统［1］。世界范围内患有SCI的患者约有2500万，而且据报道每年病例新增人数已＞13万［2］。SCI的病理生理机制是多因素的，包括血管破裂、局部缺血缺氧和水肿、炎症因子渗出、自由基形成等，这些因素共同导致损伤区域内神经元破坏、轴突退化、髓鞘脱失、空洞和胶质瘢痕的形成［3］。

过去几十年间，有关于SCI的研究呈爆发性增长，大量的实验室研究都致力于向临床实验转化［4］，从而指导临床诊治。然而现今针对脊髓横断患者的功能恢复尚无显著有效的治疗措施［5］。临床上针对SCI现有的治疗方法例如促神经生长药物的应用，手术减压，康复训练和中药熏洗等物理疗法，而这些方法对轴突连续性中断所导致的神经元靶源性营养供给减少和生理电信号及化学传递功能受损的作用甚小，因此虽有一定疗效，但不能从本质上阻止病情发展。药理学研究表明，大剂量强的松龙冲击疗法对于急性损伤有一定疗效［6］，但是由于其副作用较明显，在临床上应用受到较大限制。因此针对SCI带来的一系列问题，新的治疗手段显得尤为重要。

随着近年来组织工程学的迅速发展，利用种子细胞移植修复受损神经为SCI的研究与治疗提供了新思路，与此同时多种生物材料用于制成可移植细胞的载体系统或导管支架，其发挥桥梁作用治疗SCI的研究与应用也受到业内人士的广泛关注。大量实验研究表明，具有生物相容性的支架作为细胞载体移植入宿主体内后，能够为种子细胞提供一个相对良好稳定的环境，且有利于大量血管形成并长入支架内，能够使移植的细胞获取充分的养分并利于其代谢产物的排出。基于此，本文将对不同种类的细胞与支架联合治疗脊髓损伤的优势及其局限性作一综述，同时对支架承载细胞的联合治疗相比于其独立移植是否更有助于脊髓损伤的恢复进行讨论，旨在为进一步实验室研究和临床研究提供参考。

2 细胞联合生物支架治疗脊髓损伤

尽管分别以细胞和支架为基础治疗SCI的实验基础已趋于成熟，其单一疗法仍然存在较多局限性。采用支架单一治疗时，不能按照预期精确的调整支架性能，移植到体内的支架也不能替代受损细胞和组织达到良好的修复。另一方面，细胞单独移植时无法重建脊髓组织复杂的构架及稳定性，亦不能诱导轴突再生［7］。联合支架和细胞移植治疗SCI不仅能克服诸多再生障碍，而且能发挥良好的协同作用利于损伤后功能的恢复，下面回顾了近年来最常见的联合治疗方法。

2.1 神经干细胞（NSCs） SCI模型中植入的NSCs可以替代神经元，促进髓鞘再生从而有利于功能恢复。近年来研究表明人工合成的多聚羟基乙酸（PGA），聚乳酸（PLA）及其共聚物（PLGA）作为细胞载体共同移植至SCI模型中具有广泛的应用前景［8］。究其生物学基础，现有研究表明NSCs联合PLGA培养14d后，细胞存活并广泛分布于支架孔隙中，细胞中＞70%为微管相关蛋白2（Map2）免疫阳性细胞，且突触后密度蛋白95（PSD95），突触蛋白-I（Synapsin-I）免疫染色显示突触结构形成，说明PLGA支架诱导了NSCs分化为神经元，有效建立了突触连接［9］。JC［10］团队用灵长类动物猕猴的NSCs与自制多钛纳米纤维支架共培养后移植入SCI大鼠模型中，电镜下观察NSCs在支架的诱导下分化成神经细胞，胶质细胞和少突胶质细胞，且运动功能评分（BBB）显示联合治疗组相对于细胞组和支架组单独治疗，其后肢活动功能明显提高，差异统计学意义（P＜0.05），而细胞组和支架组的评分未见显著差异。

一些研究已证实天然聚合物充当生物支架可以对NSCs进行调节。比如，藻朊酸盐海绵或凝胶能有效抑制脊髓横断损伤后星形胶质细胞的增生，减少瘢痕形成，有利于轴突的再生［11］。与大鼠海马组织衍生出的神经球细胞共移植后，可观察到细胞存活、分化、长距离迁移，并与宿主脊髓组织融为一体［12］。与之相似，纤维蛋白凝胶也能大幅度促进轴突和树突再生［13］。

2.2 间充质干细胞（MSCs） MSCs已成为近年来公认理想的种子细胞之一，具有多分化潜能，经大量培养扩增，在特定的化学或生物诱导环境下可以分化成神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞等。联合生物材料也成为组织工程学的一种有效治疗方法，旨在增加损伤部位细胞的移植效率与存活率。例如，人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）与PLGA共移植明显增强了SCI后的功能恢复，可见损伤部位的神经丝蛋白阳性细胞密度增加［14］。在PLGA与小肠黏膜下层的复合支架（PLGA/SIS）上种植hBMSCs亦能起到诱导神经再生的作用［15］。另有研究将MSCs标记在具有三维立体结构的明胶海绵（GS）支架上，验证了明胶海绵作为一种可靠的生物工程材料，在修复受损神经组织方面具有良好的细胞适应性和组织相容性［16］。Wang等［17］模拟脊髓的多孔三维结构制作了壳聚糖支架，联合神经营养因子-3（NT-3）和BMSCs植入全横断大鼠脊髓损伤处，通过术后行为学测试，电生理和组织学评估证实了联合治疗相比于单纯支架组治疗更有利于损伤后的轴突再生和功能恢复。在临床应用方面，Sherif M. Amr等［18］在14例慢性SCI导致截瘫的患者身上应用腓肠神经作为断端桥接，联合壳聚糖-层粘连蛋白和BMSCs移植至损伤空洞处，显示患者的运动及感觉水平均有不同程度的提高，根据美国脊髓损伤协会（ASIA）评分标准，运动功能的改善中，有2例患者提高了4个等级，另12例患者提高了2个等级；在感觉功能的提高方面，有2例患者提高了6个等级，5例患者提高了5个等级，3例患者提高了4个等级，4例患者提高3个等级。下肢肌群包括大腿部屈肌群、内收肌群、伸膝肌群以及踝背屈肌的力量也有不同程度的提高，这些结果与之前将未种植细胞的腓肠神经支架移植研究相比较具有显著优势，然而这种程度的功能恢复仍不足以使患者主动站立或行走，提示支架联合细胞移植目前在临床方面的应用处于初级探索阶段，而其应用前景不可估量。

2.3 雪旺细胞 （SCs） SCs是促进外周神经损伤后修复的主要因素，因此人们将其应用于SCI后轴突与髓鞘再生的修复。实验室研究证明SCs直接移植到受损脊髓损伤部位后，断端接触面上无明显炎症反应，且脊髓两断端之间可见髓鞘再生，然而其传导功能恢复程度有限［19］，因为轴突的再生难以通过损伤处的囊性空腔或者胶质瘢痕，而联合支架的应用使这一难题得到解决。曾有学者应用载有纤连蛋白、海藻酸盐和新生儿SCs的聚羟基丁酸酯（PHB）导管植入脊髓半横断大鼠，发现轴突能够再生并穿过脊髓植入物平面［20］，由此验证支架的联合应用弥补了细胞移植的众多不足。Bamber等［21］将聚丙烯腈与聚氯乙烯（PAN/PVC）以60∶40的比例制成一种半透微管支架，其作用不仅可以引导轴突的再生方向，而且通过微管可以传递神经营养因子并限制瘢痕纤维侵入。SCs种植在支架上后观察到来自脊髓近端及远端方向的神经元轴突延伸入植入物中，并在两断端之间形成有效桥接，但是长入移植物的神经突触不能或者仅极少数能够通过远端移植物的脊髓平面。Fouad等［22］也使用了类似的方法将SCs种植于60∶40的PAN/PVC孔径里，结果可见BBB运动评分有了显著提高，移植物内有血管长入，SCs诱导桥接的再生轴突数量亦可见增加。但由于PAN/PVC支架不可吸收，可能会对远期神经再生有所限制，以及产生异物免疫反应。因此可吸收生物支架的应用有效的避免了不良反应，早在2001年就有研究应用SCs种植在聚乳酸制成圆柱状支架上嵌在脊髓断端之间，结果在支架分解前再生神经纤维的数量及髓鞘化较好，而随着支架急剧降解，再生纤维数量开始减少，由此说明支架的几何形态改变对于神经再生是有影响甚至是不利的。

2.4 嗅鞘细胞（OECs） OECs能够显著促进中枢神经系统内神经元的再生，并且减少神经凋亡，减轻胶质瘢痕的形成，同时分泌血管内皮生长因子等一系列营养因子，且有助于脊髓损伤部位的髓鞘再生和郎飞结的形成。这些特性使其成为联合治疗SCI的良好种子细胞。先前研究培养OECs并将其悬浮液注入脊髓受损组织中，发现再生轴突仅能覆盖较小面积的病变组织，而与PLGA共培养移植后，具有生物结构相似的支架发挥了桥梁作用，使得OECs促进的轴突生长能够覆盖较大面积的受损组织。Bing-Cang Li等［23］在体外测试了PLGA支架与OECs的兼容性，显示完全相容。二者的组合能够显著改善受损坐骨神经的结构和功能，并有效防止脊髓神经坏死。Novikova等［24］进行的一项体外研究测试了OECs与不同水凝胶之间的生物相容性。与藻朊酸盐水凝胶结合，OECs呈现不规则的球形，且其代谢活动受到抑制，而在藻朊酸盐中加入纤连蛋白后，细胞的增殖分化等代谢活动则明显增强。当OECs与人工基底膜共培养时，细胞的增殖扩散受到明显刺激并可观察到其特有的细胞形态。另一体外实验探究了纳米纤维凝胶材料IKVAV多肽的自组装及其与OECs的相容性。倒置显微镜结果显示不管种植在支架2D还是3D的表面，OECs都能存活，迁移并粘附在支架上，且与多聚懒氨酸共培养相比，OECs的数量、生存能力和细胞形态无明显差异［25］。Fengyu Qi 等结合了导电性聚吡咯与壳聚糖观察其对于OECs的作用，结果显示无论有无电刺激，聚吡咯/壳聚糖聚合物支架均利于细胞粘附、扩散和增殖。给予支架电刺激后，研究者们发现脑源性神经生长因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）、神经细胞粘附分子（N-CAM）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达及分泌均显著提高，而神经突产物抑制剂A（NOGO-A）的分泌及表达水平与未加入电刺激时相比则明显降低［26］。这一报道也证明了电刺激可以调节OECs的功能，包括细胞凋亡、细胞增殖和神经营养因子的释放等，使得具有导电性质的高分子聚合物为组织工程学的进一步研究开辟了良好前景。Amaia Ferrero-Gutierrez等［27］为了测试脊髓损伤后大鼠运动功能的恢复情况，在损伤部位植入了新鲜血浆衍生的白蛋白支架与OECs混合物，结果显示联合支架与细胞的治疗组大鼠与单纯支架治疗组相比较，不同时间点的BBB评分均显著提高，另外，损伤部位联合治疗组的星形胶质细胞诱导的胶质瘢痕形成显著减少，细胞内神经元和轴突的标记物表达量可见增多。

3 问题与前景

单纯的细胞移植后轴突生长较紊乱，而生物支架的作用在于为近端新生的轴突提供有效支持与导向，为细胞生长提供三维的机械支撑并引导细胞的迁移、增殖、分化以及凋亡，且能保护新生轴突免受瘢痕组织侵害。然而支架的细胞移植可能引起机体免疫排斥反应，供体部位坏死，以及传播疾病等不足，另外支架本身也有其不足，例如聚乳酸PLA导管的弱点在于过快水解，改良后的共聚物PLGA虽性质更优，但仍难以控制其本身降解速率，且制作塑型过程较复杂，体内降解的酸性产物对局部微环境可能产生不良影响。因此在SCI治疗的相关实验研究虽取得了巨大进步，但离临床的广泛应用仍有距离，临床上可能面临支架材料降解之后的细胞环境改变问题，不可降解材料术后二次取出问题，或是载体留置及崩塌问题等。客观分析，结合生物支架与细胞的优点，尽可能克服或改善各自的不足，其前景仍良好。另外，如何降低移植后可能存在的免疫反应，使移植至缺损处的细胞定向分化为功能性结构所需的细胞仍是目前亟待研究的课题。

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国家自然科学基金项目（编号：81271355）

310000 浙江中医药大学第二临床医学院（孙成龙 黄立佳 黄杨）310000 浙江中医药大学附属第二医院（邹阳 王昌兴）

*通信作者