蛛网膜下腔出血后线粒体钙超载形成机制的研究进展

张彤宇，李俞辰，戴家兴，吴培，王永朋，史怀璋

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一种常见且危及生命的脑血管疾病，发病率占全部卒中的5%，死亡率超过50%[1]。目前，临床尚无完全有效的治疗方案可确保SAH临床预后良好。传统观点认为迟发性脑血管痉挛（delayed cerebral vasospasm，CVS）是导致SAH后预后不良的主要原因，然而，新近研究表明，早期脑损害（early brain injury，EBI）才是导致SAH患者死亡率居高不下的关键因素[1]，但EBI的产生机制尚未明确。钙超载（calcium overloaded）在线粒体内可引起氧化磷酸化过程障碍，线粒体膜电位降低，三磷腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）分解加速，氧化应激水平提升，进而导致细胞的不可逆性损伤[2]。在SAH过程中产生的颅内压增高、脑血管痉挛、血脑屏障破坏等EBI症状均是引起线粒体钙超载的重要因素[1]。因此，研究线粒体钙超载的机制对于减轻EBI后神经系统损害便显得尤为重要。线粒体和与之偶联的内质网是细胞中两个主要的Ca2+储存场所，其膜上不同受体和配体的结合调控着细胞Ca2+的摄取与释放，从而维持着细胞内Ca2+平衡的稳态。随着显微技术的发展，各细胞器膜的分子层面结构已日渐清晰，其膜上各受体与配体结合产生的生物学效应也在不断被探知[3]。本文就有关线粒体及其偶联内质网上不同膜受体在SAH后形成线粒体钙超载过程中有关作用机制的研究进展做一综述。

1 线粒体内膜受体对Ca2+的摄取

相比能够透过离子和小分子的线粒体外膜，线粒体内膜有着高度选择透过性，离子在通过线粒体基质与胞质时需要特定的转运体。Ca2+跨浓度梯度在胞质与线粒体基质间转运的媒介被称为线粒体钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter，MCU）。MCU广泛表达于真核细胞中。研究证实，MCU是Ca2+单向传递的通道结构，具有Ca2+电传导通道活性，而此通道可被钌红（ruthenium red，RR）抑制，可被精胺激活[4]。García-Rivas Gde等[5]研究发现，MCU特异性抑制剂——钌360（ruthenium360，Ru360）能够通过抑制钙超载，改善心肌缺血后功能的损伤。Yan等[6]首先发现，由于SAH后铁贮存产生的EBI中存在着MCU的作用，SAH模型鼠的颞叶皮质中线粒体钙离子浓度显著提升。另有研究显示，应用RR抑制MCU，从而阻断Ca2+的贮存可以减少氧化应激，增加能量供给，逆转细胞色素C、半胱天冬蛋白酶3（caspase 3）的作用，进而减少细胞凋亡，保持神经元的完整性，改善SAH早期的相关损伤[7]。

除了MCU，线粒体Ca2+调节同时还受到线粒体Ca2+摄入蛋白1（mitochondrial calcium uptake1，MICU1）和线粒体Ca2+摄入蛋白2（mitochondrial calcium uptake2，MICU2）的双重调控。Perocchi等[8]利用比较生理学、进化基因组学和线粒体蛋白质组学相结合的方法寻找线粒体钙摄入相关蛋白时发现了MICU1。MICU1具有两个典型的EF手形结构域（EF hand domain），该结构可感知Ca2+浓度的变化。在细胞内Ca2+浓度处于低水平时，EF手型结构域提供了一个对Ca2+高亲和力的敏感集团，相当于为细胞提供了一个“门控”功能以调节MCU的活动，从而防止线粒体钙超载[9]。Mallilankaraman等[10]则发现，MICU1表达下降可导致静息状态下单向转运体活动增加，从而引起线粒体钙超载；而MICU1在细胞质内Ca2+处于低水平（＜3 μmol/L）时发挥着限制MCU相关Ca2+摄取的机制，而在细胞质内Ca2+处于高水平时反而不发挥此作用。目前研究表明，SAH等疾病后的脑部功能性障碍可能与MICU1变异导致的钙信号变化有关[11]。目前在SAH中MICU1作用仍未明确，有待进一步研究。

另一个MCU调控因子是MICU2，其与MICU1一样通过EF手型结构域调节Ca2+浓度。MICU2一直被认为与MICU1一同作用于MCU，使得Ca2+浓度呈S形分布。然而，Patron等[12]研究发现MICU1在低浓度Ca2+条件下对MCU的“门控”作用是依靠MICU2完成的，在细胞质内Ca2+处于低浓度时，MICU2起主导作用，抑制MCU的活动，减少细胞质内Ca2+向线粒体内流，抑制MICU2后MICU1可显著促进线粒体Ca2+浓度的提升；而在细胞质内Ca2+呈高浓度时，MICU1则促进细胞质内线粒体钙信号的生成，使Ca2+向线粒体钙库内流，以保证胞内Ca2+的平衡，诱发线粒体钙超载。因此，这一相互作用将有望应用于临床，在SAH中通过降低相应MICU的表达来调控Ca2+浓度，从而抑制线粒体钙超载造成的EBI。

2013年，Sancak等[13]发现了MCU重要调节因子（essential MCU regulator，EMRE），EMRE是一个10 kD大小，拥有独立跨膜结构的多细胞动物特有蛋白；敲除EMRE后，尽管MCU仍可以被激活并寡聚化，但Ca2+单向转运体的功能无法完全发挥甚至丧失，证实EMRE在MCU介导的钙超载过程中起到关键沟通作用；同时，EMRE的表达也需要MCU及MICU1的相互作用，是MICU1和MICU2以及MCU传导Ca2+的中间环节。不同于这3种钙通道相关蛋白的是，植物及原核生物中不存在EMRE，因此，EMRE在哺乳动物Ca2+调节中的特异性越来越得到重视[12]。在SAH导致的钙超载过程中，MICU1作为门控通道联合MICU2及EMRE共同调节此过程的发生发展[14]。这也使这几种受体成为SAH钙超载研究的热点之一。

2 线粒体外膜受体对Ca2+的摄取

线粒体基质内储存和蓄积Ca2+需要跨越内外两层膜，而线粒体外膜是其摄取的第一道屏障。线粒体外膜上的线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是一种具有电压依赖性、环孢素敏感性以及高传导性的膜通道。相关研究认为，mPTP主要由腺苷酸转位子（adenine nucleotide translocator，ANT）、电压依赖性阴离子通道（voltage dependent anion channels，VDACs）和亲环素结合蛋白D（cyclophilin-D，CyP-D）组成[15]。如果线粒体基质与细胞质或外界溶液之间存在浓度梯度，Ca2+可以通过mPTP而释放。因此，mPTP被认为是线粒体介导的细胞凋亡的重要结构。

mPTP组成成分VDACs是一类小分子亲水集团，是ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、细胞色素C、丙酮酸盐、苹果酸盐以及其他代谢产物的主要扩散孔道。尽管VDACs在调节线粒体钙活动中的具体作用仍有争议，但在线粒体相关的内质网膜中，VDACs与IP3R3偶联并经由GRP75介导，可控制内质网Ca2+信号进入线粒体的过程已经被证实[16]。Li等[17]在研究线粒体自噬的脑保护机制时发现SAH早期即有VDACs表达升高，分别在出血后24 h及48 h表达显著升高，而两者无显著差异，从而证实了VDACs可能与SAH引起的EBI有关。同时，Martin等[18]研究显示，VDACs在神经元中能够介导mPTP摄取Ca2+，并诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放，进而诱导神经细胞凋亡。因此，VDACs在SAH中很可能是引起钙超载的重要因素。

目前，有关mPTP另外两种组成成分ANT和CyP-D在SAH钙超载中作用的相关研究少见。但在脑损伤过程中，二者均有参与：ANT1是ANT的其中一种异构体形式，其可通过上调转移生长因子β1（transforming growth factor，TGF-β1），诱导星型胶质细胞在中枢神经系统损伤后形成胶质瘢痕[19]；而CyP-D在脑缺血时参与了由于细胞氧化应激导致的凋亡过程[20]。

3 内质网与线粒体膜偶联组分对Ca2+的摄取

线粒体外膜和内质网（endoplasmic reticulum，ER）膜紧密接触。Vance等[21]分离得到ER与线粒体相互偶联的膜组分，并命名为线粒体相关的内质网膜（mitochondria associated ER membrane，MAM）。后续研究发现，MAM在某些磷脂代谢中也具有重要作用[22-23]。Rizzuto等[24-25]通过显微镜技术发现，线粒体-内质网间物理偶联的部位可形成高浓度的Ca2+微区，证实了MAM可以影响细胞Ca2+信号调控。MAM与钙信号相关的受体很多，有三磷酸肌醇受体（inositol 1，4，5-triphate receptors，IP3Rs）和兰尼碱受体（ryanodine receptors，RYRs）等[26]。

IP3Rs受3个基因编码，每个基因均有各自不同程度的IP3亲和力。研究显示，通过敲除IP3R1和IP3R3基因可以诱导Ca2+摄取降低[27]。Chen等[28]研究发现，IP3Rs可介导Ca2+从内质网释放，从而导致神经元的损伤。Kasseckert等[29]在研究SAH后星型胶质细胞能量危机机制时发现，通过抑制IP3Rs可以限制胞质内Ca2+浓度的升高，从而降低细胞坏死率；证实了血性脑脊液可以使IP3Rs受体激活，mPTP开放，瞬时提升Ca2+浓度，从而促进线粒体钙超载形成以及神经细胞的坏死。

另一种Ca2+摄取和释放通道是RyRs，RyRs亦由三个基因编码，在神经细胞中有一定表达，虽然表达程度不及IP3Rs，但其在调节内质网-线粒体偶联组分Ca2+释放中有重要作用。RyRs能够促进细胞内Ca2+向线粒体、内质网等Ca2+贮存单位内流动，其每次开放孔道通过Ca2+量是IP3Rs的约20倍[24]。在SAH中，RyRs起着介导细胞内内质网与线粒体膜偶联组分钙超载的作用。Koide等[30]发现，SAH中存在细胞内Ca2+释放的减少，可导致细胞质内Ca2+浓度的降低和RyR2表达的下降，这证实了SAH后Ca2+在线粒体及内质网膜系统内大量蓄积导致钙超载的过程。另外，RyR1的遗传变异可能与SAH后的血管痉挛症状有关[31]。内质网-线粒体偶联部位还有许多Ca2+调节受体，如肌浆网钙泵（sarco-endoplasmic reticulum calcium atpase，SERCA）、磷酸集群分类蛋白-2（phosphoacidic cluster sorting protein-2，PACS-2）等。研究认为，这些Ca2+调节受体在脑损伤中也起着重要作用[32-33]。然而它们在SAH中的作用仍研究甚少。

综上所述，Ca2+浓度变化是由多种线粒体Ca2+相关受体共同作用的结果，这些受体的表达在线粒体与内质网之间形成了一个信号转导和功能协调的细胞生命过程。各种受体表达的相互作用共同调控着细胞的Ca2+信号通路和细胞凋亡过程。它们为SAH等疾病导致的线粒体钙超载提供了依据。在SAH诱发的线粒体钙超载过程中，待解决的问题仍有很多。首先，位于线粒体不同位置的受体在钙信号传递过程的分工合作机制还有待进一步研究。另外，一些Ca2+相关受体在SAH进程中表达的变化仍不是很明确，尤其是MICU1、MICU2和EMRE这些已明确与SAH相关的MCU密切关联的受体，有待更深一步去探究。最后，我们需要一个更加系统的，定量描述相关蛋白如何募集、组合并随环境不同变化的钙超载网络模型，以更好地研究SAH治疗的新策略。

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