金纳米基比色传感器法测定动物源食品中卡那霉素残留

袁爱梦，蔡珺珂，李彤，李颖，蔡义林，齐斌，朱颖越

(常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟,215500)

金纳米基比色传感器法测定动物源食品中卡那霉素残留

袁爱梦，蔡珺珂，李彤，李颖，蔡义林，齐斌，朱颖越*

(常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟,215500)

基于一定盐浓度下，金纳米粒子的聚集程度受附着于其表面的核酸浓度影响，以及卡那霉素(Kanamycin)能引起核酸适配体特定核酸构象变化而使其脱离金纳米粒子表面的特点，进而引起金纳米粒子颜色变化的结果，设计了一种新型检测动物源食品中卡那霉素的生物传感器。结果表明：此新型传感器对卡那霉素具有较高的灵敏度，且操作简单快速，易于普及和适于现场监控等。当卡那霉素浓度在50～200 nmol/L时，体系的吸光度A650/A519随卡那霉素浓度的变化而呈现线性关系，线性常数为0.999，检测限为30 nmol/L，且在实际样品检测中，测出其回收率为98.27%～104.31%。

卡那霉素；核酸适配体；金纳米颗粒；比色法

随着人们生活质量的提高，对食品安全和营养的要求也越来越严格，且由于抗生素[1]在动物性食品中的大量使用，其滥用残留问题也引起了广泛关注，成为研究热点。卡那霉素就是其中之一，它属氨基糖苷类，是一种广谱抗生素，抗菌效果显著[4]，但易诱发耳毒症，导致眩晕和听力减退，损害肾脏，造成肾功能衰竭，更甚者能透过胎盘屏障，对胎儿产生毒害作用[2-3]。

目前，卡那霉素的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法、分光光度法、电化学法等[5-8]。上述方法虽然准确度高，但耗时长，操作复杂，不适用于现场检测，且由于人们对抗生素残留的高度关注和对食品中卡那霉素实时、快速准确检测的要求，亟需开发一种新型的检测方法。

核酸适配体是通过指数富集技术得到的对靶目标有特异性亲和力的短链DNA序列，可以选择性地绑定到具有高亲和力的目标物如小分子、蛋白质和药物等。金纳米粒子具有独特的光学特性和较好的生物相容性，其溶液为酒红色，当在其中加入适当的盐溶液，会诱导金纳米颗粒聚集，使溶液变为蓝色。基于功能DNA原理，结合纳米材料开发生物传感器是研究的一个热点。

特异性识别卡那霉素的核酸在卡那霉素存在下其DNA构型形成复杂的半环状结构而不能吸附在金纳米表面。单链DNA附着在纳米金颗粒表面对其有保护作用，而卡那霉素可以和核酸适配体结合，使金纳米颗粒脱离核酸的保护，在一定盐浓度下发生聚集，由于表面等离子共振(SPR)作用导致不同波长处的紫外吸收峰强度减弱或增强以及相应的颜色变化。本实验研究结合以上原理构建一种新型生物传感器，用于快速灵敏地检测食品中卡那霉素的残留。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

氯金酸(HAuCl4)为分析级，购自于美国Sigma公司；柠檬酸三钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠(NaCl)均为分析纯，购买于上海化学试剂有限公司；卡那霉素购自于国家标准物质中心；乙腈(HPLC 纯，Promptar 公司)；实验用水是超纯水(>18 MΩ)。

DNA：5’-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3’，上海生工公司。

UV-2450紫外可见分光光度计，日本岛津公司；漩涡振荡器，美国Scientific Industries公司；XS105DU 型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；Thermo Aquasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm，美国热电公司)；密理博超纯水仪，北京普析通用公司。

1.2 金纳米粒子溶液的制备

实验用的金纳米粒子参照FRENS的柠檬酸三钠还原法合成[9]。具体方法如下：将新鲜配制的质量分数为 0.01%的HAuCl4溶液100 mL加到锥形瓶中，置于恒温电磁搅拌器上加热至沸腾后持续2 min，然后迅速加入2 mL，质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热，溶液的颜色由淡黄色转变到酒红色，此时金纳米粒子生成，继续加热几分钟后停止，室温搅拌使其冷却，装于棕色试剂瓶，置于冰箱4 ℃保存备用。

1.3 基于金纳米粒子检测卡那霉素的比色传感方法

配制特定盐浓度的缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，10 nmol/L NaCl，pH 7.4)，取缓冲液500 μL 加入2 mL离心管中，然后加入DNA溶液(使终浓度为10 nmol/L)，加入不同浓度的卡那霉素溶液，用振荡混合器混合，静置反应15 min左右，加入1 mL制备的金纳米离子溶液，混合反应5 min，用分光光度计扫描所得溶液，记录其A650与A519处的吸光值。利用加入卡那霉素前后吸光度的变化，实现对卡那霉素的快速检测。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

实验建立方法的传感原则是由于具有负电性磷酸骨架的特定设置的ssDNA，不仅能与卡那霉素反应形成变构效应，还可以通过静电吸引结合在金纳米的表面，增加金纳米颗粒之间的分散性，更重要的是，卡那霉素与其配子形成的绑定结合力大于ssDNA与金纳米表面的电荷吸附效应。

图1 金纳米基比色检测卡那霉素原理图Fig.1 Scheme of AuNPs-based detection of kanamycin

因此，如图1所示，当溶液中NaCl与ssDNA量恰好能维持金纳米体系的平衡时，体系的吸光度保持不变。然而，在卡那霉素存在时，ssDNA能特异性与卡那霉素结合并转变为发夹结构的DNA，发夹DNA不能吸附在金纳米表面，溶液中的NaCl此时能引起金纳米颗粒发生聚集。由于ssDNA和卡那霉素之间较强的选择性结合力，吸光度随着卡那霉素的浓度而改变，溶液的颜色从酒红色转变为蓝紫色。综上所述，一种比色定量定性检测卡那霉素的传感方法被建立。

2.2 实验条件的优化

鉴于核酸适配体的量和NaCl会直接影响到检测的结果，因而要确定核酸适配体和NaCl的最佳用量。将一系列不同浓度的核酸适配体加入金纳米体系中， 当整个反应体系中卡那霉素适配体的浓度很低时，几乎不吸附在金纳米粒子表面，在特定盐浓度下，纳米金体系发生集聚，A650/A519值较大，当核酸适配体浓度逐渐增大，除与卡那霉素作用消耗部分用量外，也能吸附在纳米金表面，进而增大它的分散度，因此，A650/A519值呈现下降趋势。实验可知，当DNA浓度控制在10 nmol/L时，纳米金体系集聚度较小，因此，选择10 nmol/L作为后续实验的最佳用量。同理对NaCl的浓度进行了优化，当NaCl的浓度为10 nmol/L时，金纳米体系聚集程度最明显，故将10 nmol/L作为NaCl的最佳浓度。

2.3 基于金纳米粒子的比色传感器检测卡那霉素

在最优条件下，用所构建的比色生物传感器检测不同浓度梯度的卡那霉素。由于卡那霉素浓度增加，纳米金表面的DNA被卡那霉素竞争性剥落，使其在10 nmol/L盐浓度下分散度降低，故体系的吸光光谱随卡那霉素浓度的增加而变化，最大吸收峰由519 nm红移到650 nm，如图2所示，同时溶液的颜色由紫红色逐渐变为浅蓝色。如图3所示，数据分析发现，体系吸光度比值y(A650/A519)与卡那霉素浓度呈现线性关系，线性方程为y=0.006x+0.084 6，相关系数为0.999，其中x为卡那霉素浓度(nmol/L)，线性范围为50～200 nmol/L，最低检测限可达30 nmol/L(三倍信噪比)。综上，通过实验分析表明，所构建方法在一定范围内具有很好的灵敏度。

图2 金纳米基体系随卡那霉素浓度变化的吸收光谱Fig.2 Absorption spectrum of the AuNPs-based system with different kanamycin concentration

图3 卡那霉素浓度和A650/A519的标准曲线Fig.3 Standard curve represented the relationship between kanamycin concentration and A650/A519

2.4 金纳米基检测卡那霉素的比色传感器方法的特异性分析

特异性是评价传感器性能的重要部分，只有对特定目标分析物作用的方法才具有实际应用前景。因此，用所构建方法检测一系列不同抗生素，如氨苄青霉素、四环素、新链丝菌素、庆大霉素、硫酸链霉素等。如图4所示，通过比较分析，当以其他抗生素代替卡那霉素时，整个体系的颜色几乎没有变化，吸光值比值变化不大，表明只有卡那霉素能够引起特异性反应，如此可用于食品中卡那霉素的快速检测。

图4 特异性分析Fig.4 Analysis of specificity

2.5 实际样品检测

为验证所建立方法的实际应用能力，采用加标回收实验。取均质后的猪肉样品至离心管中，用乙腈提取，经C18固相萃取小柱净化，将处理后猪肉试样加入不同浓度的卡那霉素标准品，用本实验方法检测其中卡那霉素浓度。实验结果表明：卡那霉素的回收率在98.27%～104.31%，故所建立方法具有很好的实际应用能力。

表1 动物性食品中卡那霉素回收率测定结果

3 结论

基于金纳米体系吸光度变化而建立的比色传感技术构建的生物检测器应用于卡那霉素的检测，检测限可达30 nmol/L，并确定了卡那霉素的传感线性范围。相比于传统的抗生素检测方法，本实验方法操作简单快速，灵敏度高，特异性强，实际样品分析检测表明其具有一定的实用性，易于现场检测，这必然会促进抗生素的实时快速检测。

[1] DEMAIN A. Pharmaceutically active secondary metabofims of microorganisms[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1999, 52(4): 455-463.

[2] ZWALD A G, RUEGG P L, KANEENE J B, et al. Management practices and reported antimicrobial usage 011 conventional and organic dairy farms[J]. Journal of Dairy Science, 2004, 87(1): 191-201.

[3] HAYNES D S. Topical antibiotics: strategies for avoiding ototoxicity[J]. Ear Nose & Throat Journal, 2004, 83(1 Suppl): 12.

[4] SELIMOGH E, KALKANDELEN S, ERDOGAN F. Comparative vestibulotoxicity of different aminoglycosides in the guinea pigs[J]. Yonsei Medical Journal, 2003, 44(3): 517-522.

[5] 郝巧艳, 王金中. 共振光散射法测定丁胺卡那霉素[J]. 化学研究, 2008, 19(3): 87-90.

[6] 冯学忠, 吴广辉, 方炳虎, 等. 紫外分光光度法测定硫酸卡那霉素注射液含量方法的建立[J]. 动物医学进展, 2010, 31(007): 110-113.

[7] 董社英, 邢远清, 罗琼, 等. 高效液相色谱法蒸发光散射检测器结合化学计量学方法测定硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素[J]. 分析仪器, 2009(1): 29-31.

[8] HOLM A I S, NIELSEN L M, HOFFNNANN S V, et al. Vacuum-ullraviolvt circular dichroism spectroscopy of DNA: a valuable tool to elucidate topology and electronic coupling in DNA[J]. Physical Chemistry Chemical Physics, 2010, 12(33): 9 581-9 596.

[9] 俞慎, 王敏, 洪有为. 环境介质中的抗生素及其微生物生态效应[J]. 生态学报, 2011, 31(15): 4 437-4 446.

[10] 王冉, 刘铁铮, 王恬. 抗生素在环境中的转归及其生态毒性[J]. 生态学报, 2006, 26(1): 265-270.

[11] 刘晓冬, 林洪, 江洁. 动物源性食品中氨基糖苷类抗生素检测技术的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2010, (8): 4 128-4 132.

[12] 付启明, 欧晓明, 刘红玉. 农产品中氨基糖苷类抗生素的残留检测方法研究进展[J]. 农药, 2009, 48(11): 784-789.

[13] 张素霞, 魏秋红. 食品中抗生素残留危害及其检测方法的分析[J]. 农产品加工, 2009(5): 62-64.

[14] 姜皓然, 李祥鹏, 玄光善. 柱前衍生化HPLC检测硫酸卡那霉素的方法研究[J]. 海峡药学, 2009(7): 85-89.

[15] 郭磊. SELEX技术及寡核苷酸适配体的近期研究进展[J]. 国际药学研究杂志, 2010, 37(4): 249-256.

[16] 郝巧艳, 王金中. 共振光散射法测定丁胺卡那霉素[J]. 化学研究, 2008, 19(3): 87-90.

[17] 郑静,林莉,程圭芳,等.基于核酸适配体和纳米材料的凝血酶蛋白特异性识别电化学生物传感器[J].中国科学(B辑化学), 2006(6): 485-492.

Kanamycin detecting in animal foods by a gold nanoparticle colorimetric biosensor

YUAN Ai-meng1, CAI Jun-ke1, LI Tong1, LI Ying1,CAI Yi-lin1,QI Bin1, ZHU Ying-yue1*

1 (School of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Under the certain concentration of NaCl, aggregation of gold nanoparticles is affected by the nucleic acid attaching to its surface. Because of nucleic acid’s conformational change by kanamycin, gold nanoparticles color can be changed. Based on this theory, a new type of biosensor has been developed to detect kanamycin in food from animal origin. The results reveal that this new sensor has high sensitivity, and operates quickly and easily. Furthermore, it is easy to use and suitable for on-site monitoring. When the concentration of kanamycin is in the range of 50-200 nmol/L, the absorption spectrum showed a linear relationship with the change of the kanamycin’s concentration, and the linear coefficient was 0.999. Meanwhile, the optimized method shows a good detection limit (LOD of 30 nmol/L), and good recoveries (98.27%-104.31%).

kanamycin； DNA； gold nanoparticle； colorimetric method

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612031

本科生(朱颖越副教授为通讯作者,E-mail：yyzhujnu@163.com)。

江苏省基础研究计划(自然科学基金)项目(BK20130379，BK20140416)；江苏省“六大人才高峰”第十二批高层次人才选拔培养(NY-021)和苏州市科技计划项目(SYN201515)；2016年度大学生创新创业训练计划项目资助(2016103330152)

2016-04-18，改回日期：2016-05-30