丹参组培条件优化研究

梁从莲，陈燕文，苏征，杨冰冰，张金成，李佳，蒲高斌,张永清

(山东中医药大学， 山东 济南 250355)

【中药与天然活性产物】

丹参组培条件优化研究

梁从莲，陈燕文，苏征，杨冰冰，张金成，李佳，蒲高斌,张永清*

(山东中医药大学， 山东 济南 250355)

为优化丹参组培快繁体系,以带腋芽的丹参植株嫩茎为外植体，观察在不同组成培养基上和不同培养条件下的丛生芽诱导及生根情况，确定最佳培养条件。结果表明，MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)+蔗糖(3×104mg/L)+琼脂(7×103mg/L)对丹参丛生芽诱导作用最好；1/2MS+IBA(1.0 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+活性炭( 5×102mg/L)+蔗糖(2×104mg/L)+琼脂(7×103mg/L)最有利于组培苗生根，组培苗的最佳生根温度为22 ℃。优化的丹参组培快繁体系，可用于丹参良种无性快繁，也可用于良种复壮及脱毒。

丹参；组织培养；快速繁殖；条件优化

丹参为唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge.) 的干燥根及根茎，可活血祛淤、通经止痛、清心除烦和凉血消痈[1]，被广泛用于治疗心脑血管系统等疾病，属于大宗常用中药材之一。目前丹参主要依靠人工栽培满足需要，山东、河南、河北、陕西、甘肃以及四川等地均有大面积种植，仅山东种植面积就达20万亩(1亩=666.7 m2)。在栽培生产中，如何提高丹参药材产量与质量备受人们关注，解决此问题最有效的途径就是选育和推广种植优良品种。关于丹参优良品种选育研究目前已有很大进展[2]，但在获得优良品种后如何充分有效地发挥作用却面临着两个方面的问题：一是如何尽快繁育、迅速推广；二是丹参在许多地区是以根段进行繁殖的，长期营养繁殖容易导致品质退化或病毒病传播，需要进行品种脱毒复壮。组培快繁技术是解决丹参快繁和丹参种苗脱毒复壮的有效手段。赵东利等[3]研究发现在幼茎、幼叶和花蕾等3种外植体中,幼茎为最佳外植体，在IAA，IBA和NAA 3种激素中,以1/2 MS+ IBA 0.5 mg/ L为最佳的丹参试管苗生根培养基。房师梅等[4]以紫花丹参茎尖、茎段、叶片和花蕾为试材，发现茎段成活率最高，丹参小苗顶芽在MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)中诱导丛生芽效果最好。周建国等[5]研究发现MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)为最适宜的芽诱导培养基。解晓红等[6]研究发现试管苗生根以MS+ IBA(1.0 mg/L)+ KT(1.0 mg/L)最好。但他们对丹参组培苗生根温度的研究较少，且很少对结果进行系统的分析。为提高丹参良种组培快繁效率，我们在前人研究基础上，以丹参嫩茎为外植体，以6-BA和NAA为芽诱导生长调节剂，以IBA和 KT为生根生长调节剂进行最佳植物生长调节剂比例的探索，并在此基础上对生根温度进行研究，同时利用统计学中的卡方检验对结果进行深入分析，进一步优化了组培条件，完善了丹参组培快繁技术体系，为大批量生产丹参优质种苗奠定了基础。

1 材料与试剂

1.1 供试材料

丹参植株嫩茎采自山东中医药大学药用植物园，原植物经山东中医药大学李佳教授鉴定，确认为唇形科植物丹参。

1.2 试药

硝酸钾(天津市广成化学试剂有限公司，2013-3-15)；硝酸铵(西亚试剂，M16715)；磷酸二氢钾(天津市广成化学试剂有限公司，2008-5-22)；硫酸镁(天津市科密欧化学试剂有限公司2010-10-24)；氯化钙(天津市博迪化工股份有限公司，2009-11-25)；碘化钾(天津市博迪化工股份有限公司，2014-9-27)；硼酸(天津市鼎盛鑫化工有限公司，2014-01-08)；硫酸锰(天津市博迪化工股份有限公司，2014-2-20)；硫酸锌(国药集团化学试剂有限公司,F20080721)；钼酸钠(天津市广成化学试剂有限公司，2013-5-30)；硫酸铜(天津市巴斯夫化工有限公司，2012-4-21)；氯化钴(天津市大茂化学试剂厂，2015-3-04)；肌醇(天津市大茂化学试剂厂，2008-11-29)；甘氨酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，2014-7-10)；盐酸硫胺素(国药集团化学试剂有限公司，20130527)；盐酸吡哆醇(北京奥博星生物技术有限责任公司，130326)；烟酸(天津市光复精细化工研究所，2014-2-19)；乙二胺四乙酸二钠(联试化工试剂有限公司，20000301)；硫酸亚铁(天津市化学试剂三厂，2008-5-30)；次氯酸钠(国药集团化学试剂有限公司，20150701)；无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，XK 13-011-00015)；6-苄氨基嘌呤(6-BA)(北京索莱宝科技有限公司，625A055)；萘乙酸(NAA)(天津市科密欧化学试剂有限公司，Q/12HB 4308-2009)；吲哚丁酸(IBA)(北京索莱宝科技有限公司，302A0322)；激动素(KT)(北京索莱宝科技有限公司，202C034)；蔗糖(国药集团化学试剂有限公司，20141224)；琼脂粉(北京索莱宝科技有限公司，402H0320)；活性炭(天津市广成化学试剂有限公司，20150815)。

2 方法

2.1 外植体处理和芽诱导培养

取带腋芽嫩茎，去叶，留叶柄基部，剪成长约2 cm带腋芽小段，清洗去表面附着物，在超净工作台上用3.148×104mg/L的次氯酸钠溶液(加2～3滴吐温)消毒15～20 min，无菌水冲洗2～3次，后用75%乙醇消毒2次，每次20～30 s，再用无菌水冲洗2～3次。然后用无菌滤纸吸去水分接种到添加有不同种类和质量浓度配比植物生长调节剂的诱导培养基上进行丛生芽诱导培养。20 d后统计外植体的出芽率。出芽率=(出芽的外植体个数/接种的外植体成活个数)×100%。培养条件为光照时间14 h/d，光照强度2000 lx，培养温度24～26 ℃。

2.2 生根培养

将芽诱导培养得到的幼嫩枝条，从基部切取并分节转入不同生根培养基上进行生根培养。 第10 天和第20 天时分别统计丹参组培苗的生根率。培养条件为光照时间12 h/d，光照强度2000 lx，培养温度24～26 ℃。根据前人经验[7-8]，以1/2 MS为基础培养基，探讨植物生长调节剂最佳组合、培养基最佳组成。再将幼嫩枝条从基部切取并分节转入最优生根培养基上，在不同培养温度下进行生根培养。每组处理接种枝节25个。

3 结果与分析

3.1 植物生长调节剂种类及浓度对丹参丛生芽的诱导作用

植物生长调节剂对丹参组培苗的芽诱导作用见表1。对表1数据采用χ2检验，结果Pearsonχ2=159.228，ν=7，P=0.000(<0.05)，可见不同处理间有差异。经进一步多重检验分析，发现1组，2组，3、4、7、8组和5、6组组内无显著性差异，但各组间差异明显，有统计学意义。细胞分裂素6-BA主要促进芽的发生，NAA能促进细胞分裂与扩大。表1数据显示，单独添加6-BA或NAA效果都不很理想，NAA在诱导丹参芽发生中并不能起主导作用，但在使用6-BA同时加入一定量NAA可显著提高6-BA促进芽发生的作用，培养基中添加6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L时，诱导丛生芽效果最好。

表1 植物生长调节剂种类及浓度对丹参组培苗的芽诱导作用

3.2 培养基组成与培养温度对丹参组培苗生根的影响

3.2.1 培养基组成对丹参组培苗生根的影响

植物生长调节剂对丹参组培苗生根的影响见表2。 对在植物生长调节剂种类及质量浓度不同培养基上培养20 d的丹参枝条生根率采用χ2检验，结果Pearson χ2=17.121，=9，P=0.047(<0.05)，提示在植物生长调节剂种类及质量浓度不同培养基上培养20 d的丹参枝条生根率不同。深入分析发现，14、15组处理与其他各组处理间有显著性差异，但其他各组之间差异不显著。表2结果显示，IBA可促进生根，但单独添加IBA效果不理想，KT的主要作用是诱导生芽，但配合一定量IBA使用可显著提高丹参组培苗的生根能力。培养基中添加IBA 1.0 mg/L和KT 1.0 mg/L，有利于丹参组培苗生根，生根率可达100%。

培养基组成对生根的影响见表3。对在基本组成不同培养基上培养20 d的丹参枝条生根率采用2检验，结果Pearson2=44.333，=6，P=0.000(<0.05)，说明基本组成不同培养基上培养20 d的丹参枝条生根率不同。进一步分析发现，22、23、24组和19、20、25组的组内处理之间结果无显著性差异，但两组之间及和21组处理之间差异显著，说明蔗糖质量浓度对生根率影响较大。表3结果显示，MS和蔗糖都减少，生根率可显著提高，提示营养成分减少改变了碳氮比而利于生根；在蔗糖和MS都减少时，向培养基中添加活性炭有利于丹参组培苗生根，推测与活性炭可为生根提供暗环境有关，但活性炭用量并不是越多越好，而是存在一定合适的范围[9]。本实验考察了3个活性炭用量，发现每升培养基添加5×102mg/L 活性炭最利于生根。

表2 植物生长调节剂种类及质量浓度对丹参组培苗生根的影响

表3 培养基基本组成对丹参组培苗生根的影响

3.2.2 培养温度对丹参组培苗生根的影响

在探索生根培养基最佳组成的基础上，将组培苗幼嫩枝条转入最优生根培养基上，即1/2MS+IBA(1.0 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+活性炭(5×102mg/L)+蔗糖(2×104mg/L)+琼脂(7×103mg/L)，在不同温度下培养10 d和20 d后分别统计组培苗生根率。结果见表4。

对不同温度下的20 d生根率采用χ2检验，结果Pearsonχ2=6.450，=3，P=0.092(>0.05)，各处理结果之间的差异无统计学意义，可能是由于样本量偏小造成的。由表4数据可以看出，培养温度在22 ℃时丹参组培苗的生根数最多。

不同条件下处理的生根率见表5。对处理20d的生根率采用χ2检验，结果Pearsonχ2=62.570，=4，P=0.000(<0.05)，显示不同条件下处理20 d后生根率有差异，深入研究发现30、31、32组与33、34组组内处理间无显著差异，而组间差异显著。表5结果显示，MS、蔗糖均减少，培养基中添加5×102mg/L活性炭和1.0 mg/L IBA、1.0 mg/L KT最有利于丹参组培苗的生根。

表4 培养温度对丹参组培苗生根的影响

表5 不同条件组合对丹参组培苗生根的影响

4 结果与讨论

丹参属于常用大宗中药材，市场需求量逐年增大，组织培养技术可以使选育的良种快速在短时间内大量繁殖，也可解决长期根段营养繁殖导致的品种退化和病毒病问题，而确定合适的组织培养条件是解决上述问题的基础，故而近年来有关优化丹参组培条件的研究报道日益增多。本实验在前人研究[3-8]基础上，着重考察了植物生长调节剂对丹参组培苗出芽和生根的影响，以及培养温度和活性炭用量对丹参组培苗生根的影响，采用卡方检验对结果进行系统分析，验证了营养成分用量应减少的合理性。结果显示，丛生芽最佳诱导培养基为MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)+蔗糖(3×104mg/L)+琼脂(7×103mg/L)，与周建国等[5]的研究结果一致。最佳生根培养基为1/2MS+IBA(1.0 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+活性炭(5×102mg/L)，与解晓红等[6]筛选出的最佳生根培养基植物调节剂用法用量一致，但他们并未添加活性炭，鉴于添加一定量的活性炭可以促进丹参组培苗生根，且成本并不高，建议添加。在设置的温度梯度中，组培苗的最佳生根温度为22 ℃，另据黄春球等的研究[10]，温度光照信号总是相互联系的，即植物以定性、定量的方式对温度和光照作出反应，当植物组织在培养基中被诱发重建时,需要较高的光照水平和适宜的温度,因为温度是通过包括基因功能的调节、各种酶活性和膜特性的控制,以及某些物质如激素水平的控制调节等来影响植物生长发育的生理生化代谢过程以影响生长,只有在适宜的温度条件下,试管植株的光合作用才能正常进行。本研究只对温度影响进行了考察，且梯度较大，将温度梯度缩小，与光照联合起来考察对生根的影响则有待进一步地研究。由于不同研究者的优化条件不尽相同，建议深入研究时要考虑丹参品种差异的影响，以使条件真正优化，节约成本且创造更高的经济效益。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:76-77.

[2]王晨,李佳,张永清.丹参种质资源与优良品种选育研究进展[J].中国现代中药,2012,14(4):37-42.

[3]赵东利,曹雪梅,邱桂佳,等.丹参的组织培养及植株再生[J].北京农学院学报,2010,25(2):5-7.

[4]房师梅，雷世俊，王洪波，等.丹参组培快繁技术研究[J].北方园艺2013(21):123-126

[5]周建国,刘珊珊,毛志远,等.丹参组织培养技术的初步研究[J].食品与药品,2015,17(2):93-95.

[6]解晓红,李江辉,冯文龙,等.丹参组培快繁技术研究[J].中药材,2004,27(7):474-475.

[7]王维婷,单成钢,房翠萍,等.丹参组织培养及其再生体系的建立与优化[J].现代中药研究与实践,2011,25(4):21-23.

[8]孟倩,孔祥生,张改娜.不同植物生长调节剂对丹参组培快繁的影响[J].北方园艺,2013(9):102-105.

[9]孙占育,孙志强,曹斌.活性炭在促进组培苗植物生根中的作用[J].湖南农业科学,2010(7):3-5.

[10]黄春球,宋天顺,李明静,等.外界条件对白及组织培养的影响[J]. 安徽农学通报,2010,16(21):42-43.

Conditions optimization of tissue culture technique ofSalviaMiltiorrhizaBge.

LIANG Cong-lian, CHEN Yan-wen, SU Zheng, YANG Bing-bing,ZHANG Jin-cheng, LI Jia, PU Gao-bin, ZHANG Yong-qing*

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶To optimize rapid propagation of tissue culture technique ofSalviamiltiorrhizaBge., we addressed the impact of its tissue-cultured plantlets by different plant growth regulators and different culture conditions with tender stems with axillary bud as explants. Results show that the most effective induction to axillary buds is MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)+sucrose(3×104mg/L)+agar(7×103mg/L). The most favorable rooting conditions of tissue culture seedling are 1/2MS+IBA(1.0 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+activated carbon(5 ×102mg/L)+sucrose(2×104mg/L)+agar(7×103mg/L) and 22 ℃ . This technique can be applied to rapid propagation, rejuvenation and detoxification ofSalviamiltiorrhizaBge.

∶SalviamiltiorrhizaBge.; tissue culture; rapid propagation; conditions optimization

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.006

2016-03-17

山东省科技发展计划(2008GG2NS02022)。

梁从莲(1990—)，女，硕士研究生，研究方向为中药资源及其质量控制。E-mail:837309887@qq.com

*通信作者，张永清(1962—)，男，理学博士，教授，博士生导师，研究方向为中药资源及其质量控制。E-mail:zyq622003@126.com

R282；S567.5+3

A

1002-4026(2016)05-040-05