生物酶对五氯联苯降解的初步研究

季蕾，陈贯虹，傅晓文，黄玉杰，王加宁，张强

(山东省科学院生态研究所, 山东省应用微生物重点实验室, 山东 济南 250014)

【环境与生态】

生物酶对五氯联苯降解的初步研究

季蕾，陈贯虹，傅晓文，黄玉杰，王加宁，张强*

(山东省科学院生态研究所, 山东省应用微生物重点实验室, 山东 济南 250014)

多氯联苯(PCBs)是具有代表性的持久性有机污染物(POPs)，其氯代数目越多，降解越难。本文以分离筛选的6株PCBs降解细菌为材料，制备了含有NADH辅酶再生系统关键酶甲酸脱氢酶(FDH)的PCBs降解复合酶，研究了其对PCBs的降解效果。结果表明，Pseudomonassp. MGB11胞内酶/FDH复合酶对五氯联苯PCB114的降解率在10 h内可达69.4%，对于高毒性、难降解的高氯PCBs的污染修复具有应用价值。

五氯联苯; 降解复合酶; 甲酸脱氢酶

工业化学品多氯联苯(PCBs)是首批被列入国际持久性有机污染物( persistent organic pollutants， POPs)公约的污染物，具有持久性、半挥发性、长距离迁移性、生物蓄积性和高毒性的污染特性[1]，其氯化程度越高，越难分解。五氯联苯作为高氯PCBs，与低氯代物相比，具有更高的毒性和持久性[2]。目前，POPs污染事故仍不断发生，及时、有效地修复污染环境，对人类健康和经济发展至关重要。

微生物降解因其低耗、易于实现原位修复、环境安全和纯生态过程的显著优点[3]，是公认的治理PCBs污染的一种环保而有效的手段。好氧微生物能够把低氯PCBs(nCl<5)氧化为氯代苯甲酸，但很难降解高氯PCBs(nCl≥5)[4]；厌氧生物过程将高氯PCBs还原成低氯PCBs，但不能破坏苯环结构[5]，PCBs好氧开环过程需要联苯双加氧酶等NADH依赖型氧化还原酶[6-8]。NADH的持续供给可通过高效、低成本的甲酸/FDH(甲酸脱氢酶) 辅酶再生系统实现[9]。

本研究针对微生物降解高氯PCBs周期长、效率低的问题，以五氯联苯为降解底物，选用实验室自行分离筛选的6株PCBs降解好氧细菌，制备含有NADH辅酶再生系统关键酶FDH的PCBs降解复合酶，提高高氯PCBs的降解效率，以实现对PCBs污染的快速修复。

1 材料与方法

1.1 实验材料

联苯(国药集团)；PCB114(2,3,4,4',5-Pentachlorobiphenyl)(Sigma-Aldrich)；正己烷为色谱纯；其他化学试剂为分析纯。

6株PCBs降解菌均由本实验室分离并保存，分别为Burkholderiasp. MGB112、Sphingomonassp. MGB12、Pseudomonassp. MGB11、Rhodococcussp. MGB10、Arthrobactersp. MGB09、Pseudomonassp. VM14。

表达博伊丁假丝酵母fdh基因的基因工程大肠杆菌E.coliBL21-fdh由本实验室构建，用于FDH的制备。

诱导培养基：蛋白胨2 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.1 g/L，NaCl 0.2 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，联苯1.0 g/L，pH=7.0。

ZYP培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO4·12H2O 9 g/L，KH2PO46.8 g/L，(NH4)2SO43.3 g/L，CaCl20.02 g/L，MgSO40.24 g/L，0.5%甘油，葡萄糖0.5 g/L，乳糖2 g/L。

1.2 实验方法

1.2.1 PCBs降解酶制备

6株PCBs降解菌分别在30 ℃、150 r/min条件下用诱导培养基培养48 h，4 ℃、8 000 r/min离心5 min，分别收集菌体及上清液，菌体用10 mmol/L PBS缓冲液(pH=7.5)稀释至原浓度的1/20，在250 W、3 s/5 s条件下进行细胞破碎20 min，离心，上清为粗酶液。

1.2.2 FDH制备及活性检测

E.coliBL21-fdh在37 ℃、150 r/min条件下经ZYP培养基培养24 h，于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，菌体稀释至原浓度的1/20，在200 W、3 s/3 s条件下进行细胞破碎6 min，离心，上清为粗酶液。

FDH活性检测：反应体系中甲酸钠1 670 mmol/L，NAD 16.7 mmol/L，10 mmol/L PBS缓冲液(pH=7.5)2 mL，加入适当稀释的酶液1 mL，蒸馏水补足4 mL，30 ℃反应5 min，测定反应前后340 nm处的吸光值，根据标准曲线计算酶活力。酶活力定义为1 min催化产生1 μmol NADH所需的酶量为1 U。

1.2.3 菌株对PCBs降解

不同菌株分别在诱导培养基中培养至饱和后，各取2 mL菌液8 000 r/min离心5 min，菌体用灭菌蒸馏水清洗2次，重悬后分别接种至50 mL 浓度为1 mg/L 的PCB114溶液中，置于摇床中30 ℃、150 r/min培养。培养7 d后测定PCB114的降解率。

1.2.4 PCBs的酶降解

反应体系为10 mL，其中10 mmol/L PBS缓冲液(pH=7.5)5 mL，PCBs降解酶1 mL，FDH 酶液1 mL，蒸馏水补足至10 mL。PCB114 终浓度1 mg/L，甲酸钠1 670 mmol/L，30 ℃水浴反应8 h后测定降解率。

1.2.5 PCBs萃取及检测

反应体系中加入10 mL正己烷，充分震荡后超声5 min，转移至分液漏斗，静置分层后分离上下相，萃取3次，合并萃取液，经无水硫酸钠脱水，旋蒸后定容至5 mL，GC-MS法测定PCB114含量。

气相色谱条件：HP-5MS色谱柱，进样口温度280 ℃，柱温100 ℃保持1 min后，升至280 ℃保持4 min，载气流速为1 mL/min，不分流进样，进样量1 μL。质谱条件：离子源为电子轰击源(EI)，能量70 eV，阱温220 ℃，传输线温度280 ℃，溶剂延迟5 min。定量分析选择SIM模式。

2 结果与分析

2.1 菌株对PCBs的降解

6株PCBs降解菌经1 g/L联苯诱导，可达到的饱和生物量如表1所示。Pseudomonassp. MGB11的菌体密度最大，其OD600值为2.05；Pseudomonassp. VM14生物量达饱和时的OD600值仅为0.57，6株细菌在诱导培养基中所达到的饱和菌体密度均较低。收集菌体转接至PCB114培养基中，7 d后有3株菌的降解率达到20%以上，其中Pseudomonassp. MGB11降解率最大，为29%(表1)，其降解能力与生物量保持一致。

表1 PCBs降解菌在诱导培养基中的饱和生物量和PCB114降解率

2.2 复合酶对PCBs的降解

E.coliBL21-fdh经诱导产酶后，收集细胞并破碎，获得的粗酶液FDH酶活力为0.633 U/mL。分别制备6株PCBs降解菌的粗酶液，与FDH粗酶按照1:1(V/V)的比例进行复配，添加至PCB114浓度为1 mg/L的降解体系，反应8 h后，PCB114降解率结果如表2所示。

表2 不同复合酶对PCB114的降解率

注：CK为MGB112粗酶液(未添加FDH)。

结果显示，8 h后MGB112、MGB11、VM14对PCB114降解率分别为57.1%、65.7%、40%，其中Pseudomonassp. MGB11胞内酶/FDH复合酶对PCB114的降解率最高(65.7%)。Burkholderiasp. MGB112胞内酶/FDH复合酶的PCB114降解率(57.1%)与其胞内酶单独作用8 h相比(7.5%)提高了6.6倍。

2.3 PCBs降解酶在细胞不同部位的分布

菌株Pseudomonassp. MGB11经培养后，对其培养液、菌体破碎液的PCB114降解能力进行比较，结果显示，在8 h内，Pseudomonassp. MGB11胞内酶/FDH对PCB114的降解率达67.5%，而添加胞外上清液/FDH的体系中未检测到降解活性，表明具有PCBs降解活性的酶主要存在于胞内，而不分泌到胞外培养液中。Ruiz-Aguilar等[10]报道，来源于细菌的PCBs降解酶大多为胞内酶，而白腐真菌可分泌胞外过氧化物酶降解

图1 复合酶Pseudomonas sp. MGB11胞内酶/FDH对PCB114的降解曲线Fig.1 Degradation curve of intracellular enzyme of Pseudomonas sp. MGB11 /FDH to PCB114

PCBs，与好氧细菌相似，降解速率与含氯量成反比，降解四氯代以上的PCBs仍比较困难。

2.4 复合酶对PCB114的降解曲线

在短时间内实现PCB114高效降解的复合酶Pseudomonassp. MGB11胞内酶/FDH，对1 mg/L PCB114的降解曲线见图1。结果显示，经8～10 h降解后，复合酶对底物的降解速率趋于稳定，10 h时PCB114降解率达69.4%。

3 讨论

目前关于高氯代PCBs降解的相关研究报道较少，多为低氯PCBs降解的相关研究。胡星等[11]筛选获得的假单胞菌SYC01对四氯联苯PCB77(0.5 mg/L)、PCB52(0.1 mg/L)的降解率分别为34%、68%。Sierra等[12]分离的好氧菌Janibactersp. MS3-02对四氯联苯Aroclor1242在7 d内的降解率为70%。本文中，对更难降解的毒性类二噁英类PCBs[13]，降解酶系仅需10 h即可降解69.4%，具有更快的降解速率。此外，微生物降解高氯PCBs的过程，一般需要先经过厌氧脱氯后，更易于好氧开环降解生成小分子。本文所使用的好氧微生物胞内酶，直接通过好氧过程可将高氯PCBs降解，操作工艺简单，适用于原位污染修复。

在PCBs污染修复方面，厌氧脱氯的研究仅局限于菌种的分离和脱氯机理的研究，而在分子生物学及酶学方面仍处于空白阶段，好氧生物降解主要集中在PCBs降解菌株的筛选、降解机理及降解相关的酶和基因方面的研究[14]，对于构建具有辅酶再生功能的高氯PCBs降解复合酶的相关研究尚属首次[15]。

利用分离筛选、富集或基因工程构建获得的具有特定降解功能的微生物，通过发酵工程及酶工程手段，提取相关酶或酶系，制备复合酶或经固定化后，用于PCBs污染土壤、水体及有机污染场地的修复，是极具应用潜力的环境治理途径。本研究将辅酶再生系统关键酶FDH引入PCBs降解复合酶的构建，实现好氧条件下对高氯代PCBs的高效降解，周期短、降解能力强、成本低且操作工艺简单，在污染环境治理、生态修复方面具有应用价值。

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Pilot study on bioenzyme degradation to pentachlorodiphenyl

JI Lei, CHEN Guan-hong, FU Xiao-wen, HUAGN Yu-jie, WANG Jia-ning, ZHANG Qiang*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

∶ Polychlorinated biphenyls (PCBs) is a representative of persistent organic pollutants (POPs). More its chlorinated number leads to more difficult its degradation . We prepared PCBs compound degrading enzyme of key enzyme formate dehydrogenase (FDH) of NADH coenzyme regeneration system with isolated 6 PCBs degradation bacteria strains as materials. We address its degrading effect to PCBs. Results indicate that degradation rate of Pseudomonas sp. MGB11/FDH compound enzyme to pentachlorodiphenyl PCB114 is up to 69.4% within 10 h. It therefore has application value in the repair for high chlorine PCBs pollutants with high toxicity and low degradability.

∶ pentachlorodiphenyl; compound degrading enzyme; formate dehydrogenase

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.015

2016-08-08

国家国际科技合作专项(2014DFE90100)；山东省自然科学基金(ZR2015YL008, BS2015HZ011)

季蕾(1985—)，女，博士，研究方向为生态修复。

*通信作者。E-mail：zhbuaiji@sina.com。

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1002-4026(2016)06-094-04