正交优选补肾活血颗粒中补骨脂和丹参等药的乙醇提取工艺

王冰 ，王友凤，李静，王燕，张伟

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.青岛市中医医院，山东 青岛 266033)

【中药与天然活性产物】

正交优选补肾活血颗粒中补骨脂和丹参等药的乙醇提取工艺

王冰1，王友凤1，李静2*，王燕2，张伟2

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.青岛市中医医院，山东 青岛 266033)

优化了补肾活血颗粒中以补骨脂和丹参为代表的醇提组提取工艺。采用正交试验方法，以补骨脂中异补骨脂素和丹参中丹参酮IIA的含量为评价指标，优化提取工艺中的乙醇体积分数、提取时间、提取次数和乙醇用量4个因素。结果表明，最佳提取工艺条件为加12倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h。该方法优选得到的提取工艺简单合理、准确可行,为后续的优选水提和制粒工艺提供了必要条件。

正交试验；异补骨脂素；丹参酮IIA；提取工艺；补肾活血颗粒

补肾活血颗粒是青岛市中医医院心内科治疗慢性心力衰竭的科研协定处方，在补肾活血汤的基础上进行的剂型研究。该方由制附子(黑顺片)、盐补骨脂、熟地黄、酒山茱萸、党参、黄芪、丹参、赤芍、炒葶苈子和大枣10味药组成。根据该制剂每味药材的化学成分和药理作用分为水提组和醇提组，其中附子、补骨脂、山茱萸和丹参为醇提组，其余6味为水提组。本试验采用L9(34)正交设计法,以醇提溶液中异补骨脂素、丹参酮ⅡA的含量为指标，确定以丹参、补骨脂为代表的醇提组最佳醇提工艺。

1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；CPA2250 型电子分析天平(美国Sartorius公司)； BuchiR215V型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；DRHH-S4数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)；KDM型可调控温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；WND-200A型高速中药粉碎机(浙江省兰溪市伟能达电器有限公司)；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海贺德实验设备有限公司)。

异补骨脂素对照品 ( 中国食品药品检定研究院，批号: 0378-200108) ；丹参酮 IIA对照品( 中国食品药品检定研究院，批号:110766-201520) ；甲醇为色谱纯 ( 天津市四友精细化学品有限公司) ；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。药材附子(黑顺片)、酒山茱萸、盐补骨脂、丹参(购自安国市平安药业有限公司)，经三级实验室张伟主任药师鉴定黑顺片为毛莨科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品；酒山茱萸为豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep. 的干燥根和根茎；盐补骨脂为豆科植物补骨脂PsoraleaecorylifoliaL. 的干燥成熟果实；丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎。

2 试验方法

2.1 正交试验方法

采用正交试验优选醇提条件，分别以9组醇提溶液中异补骨脂素、丹参酮IIA的含量为指标，对乙醇体积分数、提取时间、提取次数和乙醇用量4个因素、3个水平进行考察。正交因素和水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素和水平表

2.2 异补骨脂素测定方法

2.2.1 色谱条件

色谱柱为 Venusil XBP-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以甲醇∶水(55∶45，V/V)为流动相；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为246 nm。供试品、阴性样品和对照品色谱见图1。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取异补骨脂素4.14 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

将附子、补骨脂、山茱萸和丹参粉碎成粗粉，称取药材粗粉共9份，每份1/5处方量(约31 g)，精密称重。按照L9(34)正交设计表的条件进行试验，收集提取液，滤过，滤渣备用，滤液浓缩转移至500 mL容量瓶中，加相应体积分数乙醇定容至刻度，即得供试品溶液。

1峰 异补骨脂素；a 阴性样品；b 异补骨脂素对照品；c 供试品。图1 醇提液HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of alcohol extract

2.2.4 阴性样品溶液的制备

取除补骨脂之外的3味药粗粉，按1/5处方量(约28 g)，精密称取，加12倍量70%乙醇回流1.5 h，提取1次，过滤，滤液转移至500 mL容量瓶，定容至刻度，即得阴性样品溶液。

2.2.5 标准曲线的绘制

精密量取异补骨脂素对照品溶液1、2、4、6、8 mL分别置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀。按2.2.1项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标、对照品浓度为横坐标进行线性回归，得异补骨脂素回归方程：Y=72.501X-9.572 3(R=0.999 7)。表明异补骨脂素浓度在8.28～82.8 μg/mL的范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.3 丹参酮IIA测定方法

2.3.1 色谱条件

色谱柱为 Venusil XBP-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以甲醇∶水(75∶25，V/V)为流动相；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为270 nm。供试品、阴性样品、对照品色谱见图2。

2峰 丹参酮IIA；d 丹参阴性样品；e 丹参酮IIA对照品；f 供试品。图2 醇提液HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of alcohol extract

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取丹参酮IIA1.80 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。

2.3.3 供试品溶液的制备

取2.2.3项下供试品溶液作为丹参酮IIA的供试品溶液。

2.3.4 阴性样品溶液的制备

取除丹参之外的3味药粗粉，按1/5处方量(约27 g)，精密称取，加12倍量70%乙醇回流1.5 h，提取1次，过滤，滤液转移至500 mL容量瓶，定容至刻度，即得阴性样品溶液。

2.3.4 标准曲线的绘制

精密量取丹参酮IIA对照品溶液1、2、4、6、8 mL，分别置于10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，摇匀。按2.3.1项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标、对照品浓度为横坐标进行线性回归，得丹参酮IIA回归方程：Y=53.851X-10.197(R=0.999 8)。表明异补骨脂素浓度在7.20～72.00 μg/mL的范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.4 供试品含量测定

将1～9号供试品溶液和阴性样品溶液分别用0.45 μm微孔滤膜滤过，进样量10 μL，按上述补骨脂和丹参各自的色谱条件分别测定异补骨脂素、丹参酮IIA的含量，每项试验平行重复 3 次。

3 试验结果

采用两个指标进行综合评分，计算公式：分值=[(异补骨脂素含量/异补骨脂素含量最高值)×异补骨脂素权重系数+(丹参酮IIA含量/丹参酮IIA含量最高值×丹参酮IIA权重系数]×100,将异补骨脂素和丹参酮IIA权重系数设定为0.5，结果见表2。

表2 正交试验结果

直观分析表明，以综合评分为标准，各因素影响作用主次顺序为 C>A>B>D。方差分析(表3)表明，各因素对异补骨脂素和丹参酮IIA的含量均无显著性影响(P>0.05)。通过直观分析，综合考虑，确定醇提组的最佳醇提工艺组合为A1B2C3D3，即分别为加12倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h。

表3 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00。

4 验证试验

为进一步确定优选工艺的可靠性,取3份醇提药材，按最佳提取工艺条件进行验证试验,测得异补骨脂素和丹参酮IIA的含量分别为5.62、5.37、5.41 mg/g和2.17、2.24、2.11 mg/g。由此结果看出，在最佳提取工艺条件下，各考察指标均能达到较高水平,所得优选工艺得到验证。

5 讨论

慢性心力衰竭是各种病因引起的心血管病的严重阶段[1]，是心脏排血量不足，不能满足机体组织代谢需要的病理状态，属中医学心悸、水肿、喘证、痰饮和胸痹等症的范畴[2-3]，古人认为“久病及肾，久病多淤”[3]。

补肾活血汤由附子、补骨脂、山茱萸和丹参等10味药组成。其中补骨脂为豆科植物补骨脂PsoraleaecorylifoliaL. 的干燥成熟果实[4]，主要含有香豆素类成分[5]，具有温肾助阳功效[6]，治疗心力衰竭的肾阳虚衰、血行不畅和血瘀[7]。丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎[4]，化学成分取以丹参酮IIA为代表的脂溶性成分，具有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化和抗血栓等作用[8]。前期研究结果表明，补肾活血汤能降低慢性心力衰竭患者室间隔厚度，降低慢性心力衰竭患者血浆脑钠肽、内皮素水平，可以明显改善慢性心力衰竭患者心功能，改善血管内皮功能，抑制心室重构[1,9]。

前期预试验对因素水平进行了单因素考察，结果显示分别在乙醇体积分数大于90%、乙醇用量大于12倍、提取时间大于2 时，测得的有效成分含量相差不大，因此设定表1因素水平进行正交试验优选。

本试验把处方中10味药材依据理化性质和药理作用，对附子、补骨脂、山茱萸、丹参4味药进行乙醇提取工艺研究，选用臣药补骨脂、丹参中有效成分含量为指标，进行了正交试验，得出优选提取方案为12倍量70%乙醇回流提取3次,每次1.5 h的提取工艺，为提高制成品有效成分含量、保证临床疗效提供了保证。

[1]李洁.补肾活血汤对慢性心力衰竭患者血浆脑钠肽水平及血管内皮功能的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2012,10(10):1161-1162.

[2]李洁,安佰海,宋业琳.补肾活血法治疗慢性心力衰竭探析[J].中华中医药学刊,2012,30(9):2008-2009.

[3]安佰海,韩晶,解品启,等.补肾活血汤对慢性心力衰竭患者长正五聚蛋白3的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2015,13(1):11-13.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版一部[M].北京：中国医药科技出版社,2015:76,187.

[5]陈雯,杜守颖,陆 洋.多指标正交试验优选仙灵骨葆胶囊中丹参、补骨脂提取工艺[J].中国中药杂志,2009,34(14):1792-1794.

[6]吴疆,魏巍,袁永兵.补骨脂的化学成分和药理作用研究进展[J].药学评价研究,2011,34(3):217-219.

[7]李洁,唐明,宋业琳.补肾活血汤治疗慢性心力衰竭的临床观察[J].世界中西医结合杂志,2012,7(4):341-316.

[8]李巧玉,刘 杨,包华音.近5年丹参化学成分及药理作用研究进展[J].食品与药品,2014,16(2):145-146.

[9]王常鸿.补肾活血汤治疗肾虚血瘀型慢性心力衰竭的临床研究[D]济南:山东中医药大学,2013:11-15.

Extraction process optimization ofPsoraleaecorylifoliaL. andSalviamiltiorrhizaBge. from Bushen Huoxue Granule by orthogonal experiment

WANG Bing1, WANG You-feng1, LI Jing2*, WANG Yan2, ZHANG Wei2

(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Qingdao City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Qingdao 266033, China)

∶ We optimizedPsoraleaecorylifoliaL. andSalviamiltiorrhizaBge. extraction process of ethanol extraction group in Bushen Huoxue Granule. We also optimized ethanol concentration, ethanol dosage, extraction time and extraction times in extraction process with orthogonal experiment and contents of Isopsoralen inPsoraleaecorylifoliaand Tanshinone II A inSalviamiltiorrhizaas evaluation indexes. Experimental results show that optimum extraction conditions are 12 times 70% ethanol and three extraction times, one and a half hours per time. The extraction process is simple, reasonable, accurate and practicable, and provides necessary conditions for subsequent optimization of water extraction and granulation process.

∶ orthogonal experiment; isopsoralen; tanshinone IIA; extraction process; Bushen Huoxue Granule

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.007

2016-06-22

山东省中医药科技发展计划(2015-363)

王冰(1991—)，男，硕士研究生，研究方向为中药制剂控制区、中药外用药剂型。E-mail：wangbing7799@163.com

*通信作者，李静(1972—)，女，主管药师，研究方向为中药制剂控制区、中药外用药剂型。E-mail：lijing9002@126.com

R284.2

A

1002-4026(2016)05-045-05