NKG2D/RAE-1通路在介导NK/T细胞杀伤垂体瘤细胞中的作用及意义

孙其凯，马立新，李珍珠，陈正，李泽福

(滨州医学院附属医院，山东滨州256600)

NKG2D/RAE-1通路在介导NK/T细胞杀伤垂体瘤细胞中的作用及意义

孙其凯，马立新，李珍珠，陈正，李泽福

(滨州医学院附属医院，山东滨州256600)

目的 观察NKG2D/RAE-1通路在介导自然杀伤(NK)细胞、CD8+T细胞(两种细胞简称NK/T细胞)杀伤垂体瘤细胞中的作用，从细胞学水平探讨垂体瘤的免疫逃逸机制。方法 以小鼠垂体瘤细胞系AtT20为研究对象，采用免疫荧光标记法检测NKG2D配体RAE-1在垂体瘤细胞的表达水平及定位分布情况。采用NK/T细胞分选试剂盒分离NK/T细胞，将NK/T细胞放入Transwell小室的上室，靶细胞AtT20置入Transwell小室的下室，随机分为对照组、实验组。对照组在常规条件下共培养0、4、8、24 h，实验组在培养液中加入阻断RAE-1的抗体(Anti-RAE1 抗体)共培养0、4、8、24 h；采用MTT法检测两组各时间点细胞增殖抑制率。结果 RAE-1在AtT20细胞膜明显表达，在细胞质内亦有弱表达。在AtT20细胞中RAE-1蛋白阳性表达率为100%，其中强表达率为30%、中表达率为60%、弱表达率为10%，无阴性表达。对照组培养4、8、24 h时细胞增殖抑制率明显高于0 h时(P均<0.05)；实验组培养0、4、8、24 h时增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05)，培养8、24 h时增殖抑制率均明显高于同时间点对照组(P均<0.05)。结论 NK/T细胞通过NKG2D/RAE-1通路杀灭垂体瘤细胞，RAE-1可负反馈作用于NK/T细胞，从而抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。NKG2D/RAE-1通路可能作为垂体瘤的免疫治疗靶点。

垂体瘤；NKG2D；RAE-1；自然杀伤细胞；CD8+T细胞

垂体瘤是目前临床上最常见的鞍区肿瘤，患者预后较差；化疗、放疗和手术切除为其常用治疗方法，但均不能明显改善患者预后。免疫治疗近年来应用于肿瘤的治疗，其通过影响自然杀伤(NK)细胞、T细胞等效应细胞进而杀灭肿瘤细胞[1,2]。寻找可靠的治疗靶点是肿瘤免疫治疗的关键[2]。NKG2D是一种Ⅱ型膜蛋白，属于NK细胞特异性很高的活化性配体，在NK细胞、CD8+T细胞(两种细胞简称NK/T细胞)及其他免疫效应细胞中均有表达[3]。MICA是人类免疫效应细胞中能与NKG2D特异性结合的配体，是一种跨膜糖蛋白，具有高度糖基化[4]。目前已有研究在组织学水平证实NKG2D/MICA通路在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用，但尚无细胞水平的证据。小鼠细胞中RAE-1属于NKG2D配体，可与NKG2D结合，具有类似MICA的免疫调节作用。2014年6月～2015年12月，本研究首次在细胞水平观察NKG2D及其配体RAE-1在介导NK/T细胞杀伤垂体瘤细胞过程中的作用，探讨垂体瘤的免疫逃逸机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠垂体瘤细胞系AtT20，购自中国科学院上海细胞所。主要试剂：RAE-1抗体(Abcam)，荧光标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，NK/T细胞分选试剂盒、细胞磁珠分选试剂盒(德国美天旎公司)，Transwell小室(美国康宁公司)等。

1.2 AtT20细胞培养及RAE-1蛋白表达检测 将小鼠垂体瘤细胞系AtT20置于F-12K培养基(含15%马血清、2.5%胎牛血清)，于37 ℃、5% CO2环境下半贴壁培养，0.25%胰酶消化传代。取第二代细胞常规条件下培养，采用免疫荧光标记法检测RAE-1蛋白表达：将半贴壁培养的细胞消化吹打成细胞悬液；取细胞悬液涂于载玻片上，滴加羊血清室温封闭1 h，滴加RAE-1抗体(1∶1 000)4 ℃过夜，滴加荧光标记二抗(1∶500)室温孵育1 h，滴加DAPI标记细胞核，封片，显微镜下观察细胞。RAE-1蛋白荧光信号位于细胞膜和细胞质。免疫荧光标记的分级标准(以荧光强度分级)：0级即阴性：高倍镜下隐约可见荧光信号，低倍镜下不显示；1级即弱表达：高倍镜下可见荧光信号，低倍镜下隐约可见；2级即中表达：高倍镜下清晰可见荧光信号，低倍镜下亦可见；3级即强表达：高倍镜下可见耀眼荧光信号，低倍镜下清晰可见；4级即超强表达：高倍镜及低倍镜下均可见刺眼荧光信号。1～4级均为阳性表达，3～4级为强表达。

1.3 NK/T细胞对AtT20细胞的杀伤活性检测 采用Transwell共培养技术。采用NK/T细胞分选试剂盒，利用免疫磁珠负性筛选法分离NK/T细胞，并采用流式细胞仪进行鉴定，使分离的细胞纯度分别达到80%以上，步骤参照试剂盒说明书。将NK/T细胞放入Transwell小室的上室，AtT20细胞(靶细胞置入Transwell小室的下室(效靶比20∶1，效应细胞密度为2×106个/mL、靶细胞密度为1×105个/mL)；每批次样本设置3个复孔，中间以0.4 μm孔径聚碳酸酯膜隔开，重复3次；随机分为对照组、实验组，对照组在常规条件下共培养0、4、8、24 h，实验组在培养液中加入阻断RAE-1的抗体(Anti-RAE1抗体)共培养0、4、8、24 h；采用MTT法分别检测两组NK/T细胞在540 nm波长处的光密度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

2 结果

2.1AtT20细胞RAE-1蛋白表达RAE-1在AtT20细胞膜明显表达，在细胞质内亦有弱表达。在AtT20细胞中RAE-1蛋白阳性表达率为100%，其中强表达率为30%、中表达率为60%、弱表达率为10%，无阴性表达。见插页Ⅰ图1。

2.2NK/T细胞对AtT20细胞的杀伤活性 对照组培养4、8、24h时NK/T细胞增殖抑制率均较培养0h时增加(P均<0.05)，但培养4、8、24h时增殖抑制率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；实验组培养0、4、8、24h时增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05)；实验组培养8、24h时增殖抑制率均明显高于同时间点对照组(P均<0.05)。见表1。

3 讨论

垂体瘤是鞍区最常见的良性肿瘤，在颅内肿瘤中其发病率仅次于脑胶质瘤和脑膜瘤， 垂体瘤可发生在任何年龄，并无明显性别差异(除泌乳素腺瘤多见于女性外)[5]。目前，临床主要采用肿瘤全切并辅以放疗和化疗的方法来治疗垂体瘤，但侵袭性垂体瘤患者术后复发率较高的难题仍未解决[6]。

表1 两组培养不同时间点NK/T细胞增殖抑制率比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05；与同组0 h比较，△P<0.05；与同组4 h比较，#P<0.05；与同组8 h比较，▲P<0.05。

近年研究发现，肿瘤的发生、发展与机体免疫系统紊乱有关。NK细胞是一群大颗粒淋巴细胞，属于一类与T、B淋巴细胞不同的大颗粒淋巴细胞[7]。NK细胞具有其他淋巴细胞无法比拟的优点，即肿瘤杀伤活性(无需抗原致敏)[8]，可以快速、灵敏、直接杀伤肿瘤细胞[9，10]。目前利用NK细胞杀伤肿瘤细胞的方法正逐渐应用于临床，如IL-2激活NK细胞杀伤肿瘤，IL-2能够增加NK细胞数量，提高NK细胞杀伤肿瘤细胞(转移性肾细胞癌、多发性骨髓瘤)的活性。但是，NK细胞杀伤肿瘤细胞的具体机制及其信号通路尚不清楚。NKG2D是一种Ⅱ型膜蛋白，属于C型凝集素样受体家族，NKG2D能够结合特异的转接蛋白通过跨膜区域的带电残基完成信号转导[11]；同时，NKG2D属于NK细胞的特异性很高的活化性配体，在NK细胞、CD8+T细胞及其他免疫效应细胞中均有表达；但在正常生理条件下，NKG2D在人和小鼠CD4+T细胞中不表达[12]。本研究选用NK细胞、CD8+T细胞用于共培养实验。

NKG2D可结合许多不同的配体，这些配体均属于主要组织相容性复合体Ⅰ类(MHC-Ⅰ)相关蛋白，其中人NKG2D配体家族包括MICA和MICB。MICA是人类免疫效应细胞中能与NKG2D特异性结合的配体，是一种跨膜糖蛋白，具有高度糖基化。目前已有研究在组织学水平证明NKG2D/MICA通路在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用。Chen等[13]发现，相对于正常脑组织，MICA蛋白在垂体瘤组织中高表达，提示MICA蛋白高表达可能参与垂体瘤的发生、发展；MICA与NKG2D受体特异性结合激活NK/T细胞等效应细胞可能是其抑制肿瘤发生、发展的机制。

本研究以小鼠垂体瘤细胞系AtT20为研究对象，现已证实小鼠和人之间氨基酸序列同源性高达99%，因此该细胞系能够充分替代人源垂体瘤细胞系[14]。但小鼠细胞缺少人类MICA同源基因，在其细胞中RAE-1基因充当MICA基因的角色。RAE-1属于NKG2D配体，可与NKG2D结合，并且具有类似MICA的免疫调节作用。鉴于RAE-1在AtT20细胞的表达情况及其对垂体瘤生物学行为的影响尚不清楚，本研究首先观察RAE-1在小鼠细胞系AtT20中的表达情况，结果发现RAE-1在垂体瘤细胞膜上明显表达，同时细胞质内亦有弱表达；提示RAE-1高表达有可能参与垂体瘤的发生、发展，该结论为下一步检测NKG2D/RAE-1通路在NK/T细胞杀伤垂体瘤细胞中的作用提供了前提。本研究在阻断RAE-1配体后NK/T细胞对垂体瘤细胞的杀伤活性明显增加，提示NK/T细胞可能通过NKG2D/RAE-1通路杀灭垂体瘤细胞；阻断RAE-1配体后NK/T细胞的杀伤活性较前明显增加，提示RAE-1负反馈作用于NK/T细胞，进而抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

有研究发现，在免疫力正常的动物体内表达NKG2D配体的肿瘤仍然能继续发生、发展[15]，故肿瘤发生、发展过程中可能存在依赖NKG2D/配体通路的免疫逃逸。本研究从细胞水平证明RAE-1不仅可与NKG2D结合介导NK/T细胞杀伤肿瘤细胞，也可负反馈作用于NK/T细胞，降低NK/T细胞的杀伤肿瘤细胞活性，上述结果为研究垂体瘤免疫逃逸机制提供了依据。NKG2D配体(包括MICA和RAE-1)在机体内有两种存在形式，一种是存在于细胞膜表面的膜型配体，一种是活化脱落后被分泌到血液或肿瘤微环境中的分泌型配体。在大多数肿瘤，如骨肉瘤[16]、口腔鳞状细胞癌[17]，虽然NKG2D配体明显表达，但由于膜型配体脱落为分泌型配体，分泌型配体与NKG2D结合后使NKG2D发挥消极作用，使NK/T细胞杀伤肿瘤细胞的活性降低，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

综上所述，NK/T细胞通过NKG2D/RAE-1通路杀灭垂体瘤细胞，RAE-1可负反馈作用于NK/T细胞，从而抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。NKG2D/RAE-1通路可能作为垂体瘤的免疫治疗靶点。

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Effect and significance of NKG2D/RAE-1 pathway in the process of NK/T cells killing hypophysoma cells

SUNQikai,MALixin,LIZhenzhu,CHENZheng,LIZefu

(AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalCollege,Binzhou256600,China)

Objective To observe the effect of NKG2D/RAE-1 pathway on mediating natural killer (NK) cell and CD8+T cell (both cells were referred to as NK/T cells) killing hypophysoma cells and to investigate the immune escape mechanism of hypophysoma from the cytological level. Methods The hypophysoma cell line AtT20 was selected. The immunofluorescent labeling method was used to detect the expression level of NKG2D ligand RAE-1, its position and distribution in the hypophysoma cells. NK/T cells were isolated by NK/T cell sorting kit, and NK/T cells were placed in the upper chamber of the Transwell chamber, the target cells AtT20 were placed in the lower chamber of the Transwell chamber and then were randomly divided into the control group and experimental group. The control group was co-cultured under normal conditions for 0, 4, 8, and 24 h. In the experimental group, the anti-RAE1 antibody was added to the culture medium, and the cells were co-cultured for 0, 4, 8, and 24 h. MTT assay was used to detect the inhibitory rate of cell proliferation at each time point. Results RAE-1 was clearly expressed in AtT20 cell membrane, and there was a weak expression in the cytoplasm. The positive expression rate of RAE-1 protein in AtT20 cells was 100%, among which the strong expression rate was 30% (15/50), the moderate expression rate was 60%, the weak expression rate was 10%, and there was no negative expression. In the control group, at 4, 8 and 24 h after culture, NK/T cell proliferation inhibition rate increased as compared with that at 0 h (allP<0.05). In the experimental group, the proliferation inhibition rate gradually increased at 0, 4, 8 and 24 h (allP<0.05), and at 8 and 24 h, the proliferation inhibition rates in the experimental group were significantly higher than those of the control group (allP<0.05). Conclusions NK/T cells kill the hypophysoma cells through NKG2D/ RAE-1 pathway, meanwhile, RAE-1 has a negative feedback effect on NK/T cells and consequently inhibits the killing activity of immune cells against the tumor cells. NKG2D/RAE1 pathway can be used as immunotherapy target for hypophysoma.

hypophysoma; NKG2D; RAE-1; natural killer cells; CD8+T cells

国家自然科学基金资助项目(81171119)。

孙其凯(1989-)，男，在读硕士研究生，研究方向为垂体瘤的免疫治疗。E-mail: sunqikai4453@163.com

简介：李泽福(1969-)，男，主任医师，研究方向为垂体瘤的免疫治疗。E-mail: lizefu163@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.002

R736.4

A

1002-266X(2016)44-0004-04

2016-04-04)