6 292份脐带血的微生物检测结果分析

张 晋,佟海侠,马良艳,王殿昌,段小晶

(中国医科大学附属盛京医院辽宁省脐血库，沈阳 110022)

6 292份脐带血的微生物检测结果分析

张 晋,佟海侠△,马良艳,王殿昌,段小晶

(中国医科大学附属盛京医院辽宁省脐血库，沈阳 110022)

目的 探讨脐带血采集和处理过程中微生物污染的概率、种类，并分析脐带血收集相关因素和检测方法对培养结果的影响。方法 抽取2011～2014年脐带血分离后的血浆-红细胞悬液，分别注入需氧和厌氧培养瓶，使用BACTEC9000系列全自动血液培养系统培养5d，结果阳性者做废弃处理。对阳性标本进行病原菌鉴定，同时比较不同生产方式、采集者、采集量、采集方式、处理前时间、培养体积、延迟上机时间及培养瓶种类对微生物污染率的影响。结果 6 292份被检脐带血中阳性标本131份，污染率为2.1%。病原菌以大肠埃希菌最为常见，占23.9%，其次为凝固酶阴性葡萄球菌，占20.9%。自然分娩者脐带血标本、县市级医院采集标本、采集量低于80mL的标本阳性检出率升高，培养体积由10mL提高为20mL后阳性检出率上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 脐带血微生物污染率与生产方式、采集者及采集量相关，增加培养体积可提高检测灵敏度。

脐带血；微生物污染；血培养

Analysis on microbial contamination of 6 292 umbilical cord blood units

自20世纪90年代以来，全世界脐带血造血干细胞保存量已超过600 000份，移植量已超过30 000例，约占同种异基因造血干细胞移植的20%[1]。脐带血在采集和处理过程中有微生物污染的风险，因此所有的移植用脐带血都必须进行微生物检测，包括需氧菌、厌氧菌和真菌，检测结果阴性是脐带血造血干细胞合格的条件之一。本研究数据来自2011～2014年所有脐带血的微生物检测结果，通过对比分析旨在探讨脐带血微生物污染的概率、种类，以及脐带血收集相关因素和检测方法对污染率的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2011～2014年本脐血库共检测脐带血6 292份，对其中的阳性标本进行病原菌鉴定。脐带血收集相关因素：生产方式、采集者、采集量、采集方式及采集完成到开始处理的时间间隔(处理前时间)；检测方法：培养体积、延迟上机时间及培养瓶种类。

1.2 主要仪器与试剂 病原菌培养采用美国BD公司BACTEC9000系列全自动血液培养系统及配套专用需氧瓶和厌氧瓶，细菌鉴定使用美国BD公司Phoenix-100全自动细菌鉴定药敏系统。

1.3 方法

1.3.1 脐带血的采集与运送 参照《脐带血造血干细胞库技术规范》,胎儿娩出后，在近胎盘端对脐带穿刺部位进行严格消毒，将采血针于止血钳固定部位上端5 cm处快速刺入脐静脉，使脐带血通过重力作用流入一次性采血袋内，轻轻摇晃采血袋使血液和抗凝剂充分混匀。采集后由专人使用专用储存箱保存运输(温度保持在4～25 ℃)，送达脐血库后置于4 ℃冰箱存放，并保证在采集后48 h内完成处理。

1.3.2 微生物检测 参照纽约脐血库Rubinstein等[2]的分离方法，无菌技术抽取有核细胞分离后血浆-红细胞悬液平均注入需氧和厌氧瓶，轻轻颠倒混匀后上机检测，使用美国BD公司BACTEC9000系列全自动血液培养系统培养5 d，仪器通过分析培养瓶内荧光感应物质的变化进行结果判定。至少1个培养瓶阳性即判定该单位脐带血阳性，常规工作中按废弃处理。

1.3.3 病原菌鉴定 当血培养仪阳性报警时，观察生长曲线并进行涂片、染色、镜检和培养，使用Phoenix-100全自动细菌鉴定药敏系统及配套鉴定板进行鉴定。如果仪器提示阳性而镜检和培养未见细菌，则为假阳性。

1.3.4 不同检测方法 (1)培养体积：2011年1月至2013年10月，常规检测中取10 mL标本平均注入需氧和厌氧瓶，2013年11月至2014年12月将培养体积提高为20 mL，每瓶10 mL。两种情况下检测标本均为脐带血分离后血浆-红细胞悬液。(2)延迟上机时间：统计2013年11月至2014年8月所有脐带血培养的延迟上机时间，从将血浆-红细胞悬液注入培养瓶开始计时至放入培养仪中为止，分为12、24 h。从2014年9月开始，所有培养瓶均为注入标本后立即上机，即延迟时间为0。(3)培养瓶种类：常规检测中使用的血培养瓶为BACTEC树脂需氧瓶(Plus Aerobic)/BACTEC树脂厌氧瓶(Plus Anaerobic)。从2014年9月起，在保证培养体积和上机时间相同的条件下，对采集量大于或等于90 mL的256份脐带血同时进行了BACTEC标准需氧瓶(Standard Anaerobic/F)/BACTEC含溶血素厌氧瓶(Lytic/10 Anaerobic/F)检测。每种组合中只要有1个培养瓶阳性即判定该单位脐带血阳性。

1.4 统计学处理 使用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 微生物污染检出率 6 292份脐带血检出阳性标本131份，污染率为2.1%。2011～2014年共采集脐带血13 361份，因量少、细胞数不足、凝块、微生物污染等废弃7 289份，废弃率为54.6%，其中因微生物污染废弃131份，占总采集量的1.0%，占总废弃量的1.8%。2011～2014年微生物污染检出率呈逐年升高，差异有统计学意义(χ2=31.56，P<0.001),见图1。

图1 2011～2014年微生物污染检出率

2.2 微生物污染病原菌 131份脐带血中有118份为单一病原菌生长，3份为复合病原菌生长，1份鉴定为阴性，9份未得到鉴定结果，共计124株病原菌，病原菌种类共计27种。131份阳性标本病原菌鉴定结果见表1，其中大肠埃希菌和凝固酶阴性葡萄球菌最为常见，分别占23.9%和20.9%。

2.3 脐带血收集相关因素对微生物污染率的影响 131份阳性标本中，95份来自自然分娩者，36份来自剖宫产者；75份标本由县市级医院采集者采集，其余56份由三级综合医院采集者采集；采集量低于80 mL的标本88份，80 mL及以上的标本43份；第3产程采集72份，第3产程+体外采集55份，体外采集4份；处理前时间小于12 h的标本9份，大于24 h的标本43份。自然分娩者脐带血标本、县市级医院采集标本、采集量低于80 mL的标本阳性率分别高于剖宫产者脐带血标本、三级综合医院采集标本和采集量大于80 mL的标本，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 阳性标本病原菌鉴定结果[n=134▼,n(%)]

*：缓症链球菌3株、草绿色链球菌1株、无乳链球菌2株、中间链球菌2株；#：产气肠杆菌2株、阴沟肠杆菌5株；△：粪肠球菌4株、屎肠球菌1株；▽：脆弱拟杆菌1株、普通拟杆菌1株；▲：荧光假单孢菌1株、斯氏假单孢菌1株；▼:131份脐带血中3份为复合病原菌污染，故n=134。

表2 脐带血收集相关因素对微生物污染率的影响

2.4 检测方法对培养结果的影响 培养体积由10 mL提高为20 mL后，阳性检出率升高，差异有统计学意义(χ2=39.93，P<0.001)；延迟上机时间为24 h时，阳性检出率低于0、12 h，但差异无统计学意义(χ2=1.13，P=0.568)；使用树脂需氧瓶/树脂厌氧瓶进行常规检测的743份脐带血中阳性25份，阳性率为3.4%，同时使用标准需氧瓶/含溶血素厌氧瓶检测的256份脐带血，其阳性标本与常规血培养瓶检测结果相同，见表3。

表3 检测方法对培养结果的影响

3 讨 论

脐带血作为干细胞的来源之一已经得到广泛认可，然而在实际工作中相当一部分脐带血在采集后由于采集量少、细胞数不足、凝块、微生物污染等原因被废弃，本研究脐带血总废弃率高达54.6%，其中微生物污染废弃脐带血占总废弃量的1.8%。由于脐带血从开始采集到完成处理要经过很多步骤，整个过程难免受到污染，降低脐带血微生物污染率不仅可以节约工作成本，同时在一定程度上保证了移植患者的安全。因此，必须严格规范采分操作并提高检测方法的灵敏度。

随着脐带血相关技术的成熟，脐带血污染率一般为3%左右，本研究为2.1%，张乐玲等[3]报道为1.8%，而Clark等[4]报道为4.0%。微生物污染率呈现升高趋势的可能原因：(1)随着采集范围的扩大，许多县市级医院开始采集脐带血，但采集者经验有限，很可能会造成污染率提高；(2)检测方法的改进提高了微生物的检出率。Chen等[5]已研究表明，定期对采集频率较低的采集者进行理论和实践培训，可有效提高采集人员的技术水平，从而降低污染率。

本研究病原菌鉴定结果显示，大肠埃希菌和凝固酶阴性葡萄球菌最为常见，与其他报道基本一致[3-4]。自然分娩时污染率明显高于剖宫产，这是由于产妇阴道内含有大量细菌，同时自然分娩时有羊水、胎粪污染手术台面，胎盘和脐带极易受到污染[6]。此时采集者应高度重视无菌操作，可考虑联合使用消毒剂如75%乙醇和氯已定，后者作用持久，可有效弥补乙醇蒸发速度快的缺点；同时，增加对脐带穿刺部位的消毒次数，尤其要避免反复穿刺[7]。除此之外，对于需要保存脐带血的产妇可建议其剖腹生产。脐带血采集者应是经过专业培训并取得合格证的医师或助产士，要求经验丰富并能够处理突发事件，然而县市级医院采集者的采集频率较低、采集经验不足，因此要加强理论知识和实践操作的培训和考核。当脐带血采集量低于80 mL时阳性率明显升高，说明采集技术是影响脐带血污染的主要因素之一。采集技术欠佳、多次穿刺采集是造成采集时污染的主要原因，采集者应使采血针尖斜面向下并一次性完全进入血管内，针体反复进出血管会增加污染概率，切不可为增加采集量反复穿刺而忽视严格的消毒规程。体外采集法与体内采集法的阳性率无明显差异，但自然分娩时，通过体内采集能够获得更多的有核细胞数、CD34+细胞数及集落细胞数，有利于提高库存脐带血的质量；而剖宫产时，采集法对脐带血质量并无影响[8]。因此，为保证脐带血的低污染和高质量，可引导采集人员根据生产方式选择不同的采集方法，例如当自然分娩时可选择体内采集法采集脐带血。脐带血污染率虽未升高，但随着采集后存放时间的延长，造血干祖细胞的集落形成能力会逐渐下降，因此脐带血采集后应尽快处理[9]。

加大培养体积会提高检测方法的灵敏度，这一结论具有重要的指导意义。因为移植患者免疫力低下，低浓度病原菌也可能导致其死亡，同时干细胞体外扩增技术和脐带血双份移植技术的大力开展也对微生物的检测方法提出了更高的要求。延迟送检时间并不影响检测结果，这一结论与汤瑾等[10]认为的送检时间不会影响血培养结果一致，但孙景勇等[11]认为培养瓶在室温放置24 h，细菌的阳性检出率会明显下降，结论不同可能与其研究的最长延迟时间仅为16 h有关。由于细菌会在培养瓶内生长从而引起荧光变化，当放入仪器时已不能被检出，而且根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)血培养推荐指南，血标本接种到培养瓶后应立即送检，切勿冷藏，实际工作中应尽快送检[12]。

美国BD公司BACTEC9000系列全自动血液培养系统配套的树脂培养瓶通过吸附和离子交换作用可减少抗菌药物对细菌生长的影响，主要适用于已接受抗菌药物治疗的患者。考虑到孕妇这一特殊群体很少使用抗菌药物，而且溶血素配方能够溶解红细胞、白细胞，释放营养物质和被吞噬的细菌，从而提高细菌检出率。本研究结果显示，两种培养瓶组合在检测256份脐带血时的阳性检出率相同，可考虑将树脂需氧瓶/树脂厌氧瓶更换为成本较低的标准需氧瓶/含溶血素厌氧瓶。

综上所述，为提高合格脐带血的数量和比例，脐带血库应加强对采集者和实验室人员的培训，使其熟练掌握采集技术，严格执行无菌操作制度。在保证母婴安全的同时，应选择污染风险较低的生产方式和采集方法，采集后及时处理和送检，以降低脐带血的污染废弃率。

[1]Ballen KK，Gluckman E，Broxmeyer HE．Umbilical cord blood transplantation:the first 25 years and beyond[J]．Blood，2013，122(4)：491-498.

[2]Rubinstein P，Dobrila L，Rosenfield RE，et al．Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92(22)：10119-10122．

[3]张乐玲，马丽霞，王素兰，等．脐血采分和长期冻存后细菌培养的研究[J]．国际儿科学杂志，2012，39(2)：212-214．

[4]Clark P，Trickett A，Stark D，et al．Factors affecting microbial contamination rate of cord blood collected for transplantation[J]．Transfusion，2012，52(8)：1770-1777.

[5]Chen SH，Zheng YJ，Yang SH，et al．Microbial contamination of the Tzu-Chi Cord Blood Bank from 2005 to 2006[J]．Acta Paediatr Taiwan，2008，49(1)：9-13．

[6]任亚方，王刑刑．新生儿肠道细菌定植研究进展[J]．国际儿科学杂志，2010，37(1)：101-103．[7]SegersP，SpeekenbrinkRGH，UbbinkDT，etal．Preventionofnosocomialinfectionincardiacsurgerybydecontaminationofthenasopharynxandoropharynxwithchlorhexidinegluconate[J]．JAMA，2006，296(20)：2460-2466.

[8]柴怡．脐带血采集方式以及质量影响因素的研究进展[J]．医药前沿，2014，4(8)：15-16．

[9]路瑾，邱广凤．脐血体积浓缩前存放的温度条件及时间界限[J]．新疆医科大学学报，2002，25(1)：66-68．

[10]汤瑾，王坚镪，陈瑜，等．BDBACTEC9240全自动血液培养系统在检测血流感染病原菌的影响因素评价[J]．检验医学，2013，28(7)：606-610．

[11]孙景勇，周敏，倪语星．延迟放瓶对两种血培养系统BacT/AlERT3D与BACTEC9120阳性检出率的影响[J]．中华医院感染学杂志，2009，19(16)：2210-2212．

[12]AkanQA，YildizE．Comparisonoftheeffectofdelayedentryinto2differentbloodculturesystems(BACTEC9240andBacT/Alert3D)onculturepositivity[J]．DiagnMicrobiolInfectDis，2006，54(3)：193-196.

ZhangJin，TongHaixia△，MaLiangyan，WangDianchang，DuanXiaojing

(CordBloodBankofLiaoningProvince,ShengjingHospitalofChinaMedical

University,Shenyang,Liaoning110022,China)

Objective To investigate the rate of microbial contamination and types of pathogenic bacteria during collection and processing of umbilical cord blood units,and to explore the effects of umbilical cord blood collection related factors and detection methods on culture results.Methods The plasma and red blood cell suspension specimens from 2011 to 2014 were collected and poured into aerobic culture flasks and anaerobic culture flasks.Microbial contamination was detected by using the BACTEC9000 automatic blood culture system for 5 d,and all the positive samples were separated and identified for microbial species.The effects of several factors,including mode of delivery,collectors,volume of sample,collection method,time before sample handling,volume of culture and kinds of culture flask,on microbial contamination were also discussed in this study.Results In the 6 292 units of umbilical cord blood tested,131 units were contaminated by pathogenic bacteria,and the contamination rate was 2.1%.The most common pathogenic bacteria were Escherichia coli(23.9%) and coagulase negative staphylococci(20.9%).The positive rate was increased in specimens collected from women underwent vaginal delivery,specimens collected by collectors in county(municipal) hospitals,and specimens whose blood volume was less than 80 mL;moreover,the positive rate was ascended when the culture volume increased from 10 mL to 20 mL,there was statistically significant difference(P<0.05).Conclusion Microbial contamination was associated with mode of delivery,collector and blood volume,the increase of culture volume could promote the sensitivity.

umbilical cord blood；microbial contamination；blood culture

张晋(1986-)，检验技师，本科，主要从事脐带血研究。△

Tel：18940257287；E-mail：tonghx2009@163.com。

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.025

R

A

1671-8348(2016)35-4980-03

2016-08-13

2016-10-23)