獭兔玉米赤霉烯酮中毒的诊断

刘吉山,肖跃强，唐世云，谢金文，姚春阳，莫 玲，黄 兵

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东省农业科学院家禽研究所， 山东济南 250023)

獭兔玉米赤霉烯酮中毒的诊断

刘吉山1*,肖跃强1，唐世云1，谢金文1，姚春阳1，莫 玲1，黄 兵2*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东省农业科学院家禽研究所， 山东济南 250023)

山东某獭兔场饲养的3 000只母兔发生了一种以流产及青年兔死亡为特征的疾病，通过对发病兔进行细菌培养及兔病毒性出血症病毒的RT-PCR以及饲料中的玉米赤霉烯酮、呕吐毒素及黄曲霉毒素进行鉴别检测，首先排除细菌病及兔病毒性出血症发病的可能，并从饲料中检测3种毒素的含量分别为1 196.1、130.8、6 μg/kg，经过对照饲料标准发现玉米赤霉烯酮严重超出标准(标准为300 μg/kg)。通过饲喂试验发现这次发病与所饲喂的饲料有关，诊断为玉米赤霉烯酮中毒。

獭兔；玉米赤霉烯酮；中毒；诊断

在家兔饲料或饲料原料中生长的霉菌主要有3种，即曲霉菌、青霉菌和镰刀菌。玉米赤霉烯酮(ZEA)是一种特殊毒性的生物毒素具有类雌激素作用，它除了对繁殖机能造成影响外，还具有肝毒性、免疫毒性、细胞毒性和遗传毒性，且对肿瘤的发生也有一定影响[1-2]。低浓度水平的ZEA会引起青春期前动物的外阴道炎，连续饲喂高浓度的ZEA使动物产生持续动情期、假孕和不孕的现象[3]，能引起家兔雌激素功能亢进的效应，如阴道脱垂、阴门肿大、乳腺肿胀，也能够引起家兔流产、死胎、瘫痪、肠炎、便秘、青年兔死亡等，并损伤家兔免疫机能，导致多种疫苗免疫失败，从而引发兔场疫病流行[4]。

本文报道的是饲料中ZEA超标引发的青年兔、母兔拒食，随后青年兔死亡，近50%母兔出现流产的病例。该兔场饲养母兔3 000余只，在更换不同品牌兔饲料后12 d，大群兔陆续出现采食减少的现象，3 d后青年兔完全拒食，兔体重越大情况越严重，日死亡20余只;母兔出现流产、拒食，至我处诊断时已20%左右有流产，随着病情发展，流产率达到50%，近500只母兔流产。剖检死亡兔可见肝脏呈黄色，布满大小不一的黄白色坏死灶及坏死区域、肝硬化、腹水，肾脏出血、坏死。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 被检样品

1.1.1.1 病料 无菌采集死亡獭兔的肝脏、脾脏、肺脏及肾脏，置于2℃～8℃冰箱备用。

1.1.1.2 饲料样品 采集发病兔场饲喂的饲料，置于塑料袋内保存备用。

1.1.2 培养基 马丁肉汤，山东雨林生物制品有限公司产品，配制按说明书进行，灭菌后加入10 mL/L裂解血和40 mL/L鸡血清；马丁血清裂解血平板，在以上基础上加入20 g/L琼脂粉，灭菌，倾倒平板即可[5]。明胶、MR等生理生化培养基按常规方法配制[6]。

1.1.3 兔病毒性出血症病毒引物 根据谢金文等[7]报道的兔病毒性出血症病毒基因组序列，应用Primer Premier 5.0软件辅助各设计一对引物。引物由上海生物生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为：RHDV1:5′-CGTGCTGAGCCAGATGTA-3′,RHDV2:5′-GGTTGCAGTCCCACTATTT-3′，理论扩增片段长486 bp。

1.1.4 霉菌毒素检测试剂 ZEA ELISA检测试剂盒、黄曲霉毒素ELISA检测试剂盒、呕吐毒素ELISA检测试剂盒，山绿都生物科技有限公司产品；甲醇，国药集团化学试剂有限公司产品。

1.1.5 实验动物 6只体重1.2 kg清洁级健康獭兔，山东绿都科技有限公司实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 临床症状与剖检病变 首先了解发病兔临床症状，并剖检发病兔，观察脏器组织的病理学变化。

1.2.2 细菌培养 无菌采取病死兔肝脏、脾脏、肾脏、肺脏，无菌操作分别涂布接种2个鲜血琼脂平板，其中1组大气环境，37 ℃培养48 h。另一组厌氧，37℃培养48 h，观察有无细菌菌落生长[6]。

1.2.3 兔病毒性出血症病毒RT-PCR检测 根据文献[7]进行。无菌取病兔的肝和脾等组织进行研磨，反复冻融3次，离心后取上清，经RNA提取→反转录合成cDNA→PCR扩增→10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测流程，判定是否为RHDV感染所致。

1.2.4 饲料中霉菌毒素检测 根据文献[8-9]进行。

1.2.4.1 毒素提取 称取粉碎样品1.0 g ± 0.05 g至离心管中，加入 10 mL 样品提取液震荡，离心，取上清液稀释100倍。

1.2.4.2 反应 取稀释后的上清液50 μL，加到对应的微孔中，加入ZEA酶标物50 μL/孔， 再加入ZEA抗体50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20 min。

1.2.4.3 洗板 按常规方法进行。

1.2.4.4 显色 分别加入底物液A液、B液各50 μL/孔，振荡混匀，置37℃避光环境中反应10 min。

1.2.4.5 测定 加入终止液50 μL/孔，用酶标仪立即测定450 nm处的吸光度值。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中ZEA实际浓度[8-9]。同时按照试剂盒的说明书(检测方法同ZEA)对饲料中的黄曲霉毒素和呕吐毒素进行检测，并根据相应的分析软件进行分析得出相应的毒素含量。

1.2.5 动物试验 将獭兔分为2组，试验组4只，对照组2只，在同一间舍内饲喂，试验组饲喂发病场内的饲料，对照组饲喂其他品牌饲料，连续饲喂21 d，观察结果。

1.2.6 治疗 全群立即停止饲喂该品牌该批饲料，逐步加入另一批次饲料，并且全群饮水中加入50 g/L葡萄糖和1 g/L维生素C，连续应用3 d。

2 结果

2.1 临床症状与剖检病变

临床症状主要表现为青年兔、母兔拒食，随后青年兔死亡，近50%母兔出现流产的病例。日死亡20余只，兔体重越大情况越严重；剖检死亡兔可见，肝脏呈黄色、布满大小不一的黄白色坏死灶，肝硬化、腹水，腹腔纤维素性渗出(图1)；肾脏出血、坏死(图2)。

2.2 细菌培养

无论在正常还是厌氧环境均无细菌菌落生长，涂片、镜检未发现细菌。

2.3 兔病毒性出血症病毒RT-PCR检测结果

阳性对照扩增出486 bp大小的特异性条带，而组织样品上清液与阴性对照均未扩增出486 bp大小的特异性条带(图3)，判为阴性。

图1 肝脏剖检病变

图2 肾脏剖检病变

M.DNA 标准DL 2 000;1.样品PCR产物；2.阳性对照；3.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products of sample;2.Positive control;3.Negtive control

图3 RHDV RT-PCR鉴定结果

Fig.3 Identification result of RHDV by RT-PCR

2.4 饲料霉菌毒素检测结果

检测结果见表1。由检测得知饲料中ZEA含量达到1 196.1 μg/kg，其上限为300 μg/kg，属于严重超标范畴，此次发病应与此有关。

2.5 动物试验结果

连续饲喂至9 d，试验组开始出现剩料，至13 d剩料逐渐增多，15 d后拒食，精神不振，死亡2只，剖检后与临床发病相似，剩余2只剖检后，出现了肝脏坏死病变。对照组2只连续饲喂至21 d无临床变化。由此得知该兔场发病与所喂饲料相关。

2.6 治疗

经更换饲料，并且使用50 g/L葡萄糖和1 g/L维生素C，大群于24 h后逐步恢复饮食，48 h停止流产。

表1 被检饲料中毒素含量

Table 1 The contents of zearalenone,vomitoxin and aflatoxin in detected feed samples

毒素Toxin含量/(μg·kg-1)Content参考标准/(μg·kg-1)Referencestandard是否超标Overstandard黄曲霉毒素Aflatoxin60～50否No呕吐毒素Vomitoxin130.80～1000否No玉米赤霉烯酮Zearalenone1196.10～300是Yes

3 讨论

从动物发病与临床剖检病变，经实验室诊断，采用RT-PCR与有氧、厌氧细菌分离培养分别排除了发病症状类似的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病等微生物感染所引的发病。经动物饲喂试验，当健康家兔饲喂该种类饲料至第9天时，试验兔出现了明显不适，15 d时出现死亡，并且拒食，而饲喂其他种类的饲料未出现临床症状，表明该种类饲料与家兔发病直接相关。进一步检测发现，饲料中黄曲霉毒素、呕吐毒素含量低于国家最高标准，而ZEA达到1 196.1 μg/kg，属于严重超标范畴，临床症状亦符合该毒素中毒的临床症状，即家兔流产、死胎、瘫痪、肠炎、便秘、青年兔死亡等。剖检变化亦符合该毒素中毒的症状，即肝脏坏死、肾脏出血、坏死、腹水等。因此从多方面来判定，该兔场发病为饲料中ZEA含量高，导致饲养兔中毒。

ZEA是真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于饲料及饲料原料中。作为一种内酯类化合物，它具有类雌激素作用，能够产生肝毒性、免疫毒性、细胞毒性和遗传毒性，给养殖业和人类健康造成了极大的危害。合理的存储方式可以减轻ZEA产生的机率。饲料中霉菌毒素一直是影响动物健康的主要因素之一，特别是对于家兔饲料，不仅玉米中霉菌毒素含量高[10-11]，而且花生蔓、地瓜秧等优质粗纤维饲料，在田间生长期就有部分霉变，把它作为饲料原料储存，如果贮存不当，极有可能出现霉菌二次生长从而产生大量霉菌毒素，使其含量大大超标，从而引发家兔霉菌毒素中毒。

ZEA中毒的治疗，一般无特效解毒药，只能先停止饲喂可疑饲料，采取非特异性一般治疗措施，即饮用葡萄糖水及维生素C等，以缓解其临床症状，增加肝脏的解毒能力，促进排泄，从而减轻症状，在本次治疗过程中，采取葡萄糖水及维生素C的治疗方法效果良好。目前，对于饲料中的霉菌毒素的脱毒，主要是两种方式，一是物理吸附法，即以蒙脱石为代表的霉菌吸附剂，二是生物酶去除法[12]。前者吸附作用特异性差，长期应用会导致动物营养缺乏，后者特异性强，因此每种毒素都需要一种解毒物质，并且需要在体内反应时间太长，因此，目前对于饲料中霉菌毒素的去除还没有有效成熟的解决方式，在临床实践中只要怀疑该病就要首先停喂该批次饲料，然后再采取对症治疗的措施，缓解兔体反应。

目前，我国在家禽、牛及猪饲料中霉菌毒素的含量都有明确的规定，但在家兔饲料中尚未有明确规定。本次报告中饲料中霉菌毒素的最高标准参考了家禽和猪饲料的国家标准，通过检测发现ZEA达到了1 196.1 μg/kg，国标上限为小于300 μg/kg。霉菌毒素对于家禽、猪等动物的影响，在各种学术期刊中都有很多的报道，对于家兔的报道却很少，鲜有提及，家兔作为草食性动物，各种植物中都存在发霉的情况[10，13]，特别是秸秆类饲料，极有可能在田间污染，因此，作为饲料生产企业在生产过程中要格外谨慎，防止霉菌毒素对家兔带来伤害，从而引发与养殖户经济纠纷。

[1] 何学军，齐德生.玉米赤霉烯酮的毒性研究进展[J].中国饲料，2006(10)：2-5.

[2] 邓友田，袁 慧.玉米赤霉烯酮毒性机理研究进展[J].动物医学进展，2007，28(2):89-92.

[3] 赵建华，邹 杨，姜淑贞.玉米赤霉烯酮毒害作用研究进展[J].山东畜牧兽医，2008(8)：45-47.

[4] 刘吉山，王玉茂，张松林.兔场流行病防控技术[M].北京：金盾出版社，2013：134-140.

[5] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京：中国农业出版社，1994：237.

[6] 陆承平.兽医微生物学[M].3版.北京：中国农业出版社，2001：248-252.

[7] 谢金文，李 峰，王金良，等.兔病毒性出血症分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2013(11)：28-29.

[8] 邓舜洲，何庆华，章 英，等.竞争间接ELISA检测饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮[J].江西农业大学学报，2006，28(2)：289-292.

[9] 王景琳，张志东.竞争间接ELISA检测谷物饲料中的玉米赤霉烯酮[J].中国兽医学报，1994，14(12)：154-157.

[10] 李荣涛，谢 刚，付鹏程，等.小麦和玉米中玉米赤霉烯酮污染情况初探[J].粮食储藏，2004，32(5)：36-38.

[11] 姜淑贞，杨维仁，杨在宾.玉米赤霉烯酮的代谢、毒性及其预防措施[J].动物营养学报,2011，23(2)：196-202.

[12] Vrabcheva T,Gessler R,Usleber E,et al.First survey on the natural occurrence ofFusariummycotoxins in Bulgarian wheat [J].Mycopathologia,1996,136(1):47-52.

[13] Paster N,Blumenthal-Yonassi J,Barkai-Golan R,et al.Production of zearalenoneinvitroand in corn grains stored under modified atmospheres [J].Int J Food Microbiol,1991,12(2-3):157-165.

Diagnosis of Zearalenone Intoxication in Rex Rabbits

LIU Ji-shan1,XIAO Yue-qiang1,TANG Shi-yun1,XIE Jin-wen1,YAO Chun-yang1,MO Ling1,HUANG Bing2

(1.BinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong,256600,China; 2.Poultryinstitute,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan,Shandong,250023,China)

A disease，which is characterized by abortion in 3 000 female rabbits and death of yong rabbits,emerged in a warren in Shandong province.The detections of zearalenone,vomitoxin and aflatoxin in feed were performed.The results showed that the contents of zearalenone,vomitoxin and aflatoxin were 1 196.1 μg/kg, 130.8 μg/kg and 6 μg/kg,respectively,and the content of zearalenone was much higher than that of the feed standard (300 μg/kg).The feeding test showed a correlation between the disease and the feed with higher zearalenone level.Furthermore,the bacterial culture and RT-PCR of rabbit viral hemorrhagic disease virus (RHDV) for differential diagnoses were also performed, and the possibility of bacteriosis and RHD were excluded. It was concluded that the disease was caused by zearalenone intoxication.

rex rabbit; zearalenone; intoxication; differential diagnosis

2015-10-19

山东省现代农业产业技术体系项目(SDAIT-18-001-06)

刘吉山(1975-)，男，山东高唐人，副研究员，硕士，主要从事生物制品学与兽医临床研究。*通讯作者

S858.291;S859.81

B

1007-5038(2016)05-0129-04