2013年-2015年广西宠物犬流感流行病学调查

周华波，赵卫锋，何 平，黄小武，杨文娟，李瑞凯，何剑桥，谢 婷，韦祖樟，黄伟坚，陈 樱*

(1. 广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2. 南宁市华波宠物医院，广西南宁 530004；3. 柳州市动物疫病预防控制中心，广西柳州 545006；4. 河池市动物疫病预防控制中心，广西河池 547000

2013年-2015年广西宠物犬流感流行病学调查

周华波1,2，赵卫锋1，何 平1，黄小武3，杨文娟1，李瑞凯1，何剑桥1，谢 婷4，韦祖樟1，黄伟坚1，陈 樱1*

(1. 广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2. 南宁市华波宠物医院，广西南宁 530004；3. 柳州市动物疫病预防控制中心，广西柳州 545006；4. 河池市动物疫病预防控制中心，广西河池 547000

针对2013年-2015年广西11个地级市的宠物犬群进行犬流感调查，发现钦州犬流感感染的阳性率高达40%，除百色和玉林外，其余的阳性率在14.29%～34.29%之间，结果表明犬流感在广西呈普遍流行态势。此外，对不同品种、性别和生长阶段的宠物犬感染CIVs进行了调查分析。结果发现，任何品种和性别的宠物犬都可以感染犬流感病毒，其中青年阶段(6月龄～2岁)的犬最为易感。2015年的调查中，成年犬(2岁～7岁)成为潜在的易感群体。结果为更好地指导宠物医生采取有效的措施控制疾病发生，从而切断宠物犬作为中间传播者的作用，为防控人类大流感的暴发提供了间接帮助。

宠物犬；犬流感病毒；临床流行病学

犬流感(Canine influenza,CI)是由犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)引起的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病。自从2004年美国佛罗里达州暴发H3N8亚型流感病毒感染赛犬事件，该病毒陆续波及到美国的30个州，并且通过血清学调查表明H3N8亚型病毒不仅感染赛犬，而且可感染宠物犬[1]，“犬流感”的命名由此而产生。随着社会结构和人们生活方式的改变，健康的生活模式已经成为人们的追求方向。宠物作为人类伴侣，它所充当的角色不仅仅是娱乐，更重要的是从心理和生理上满足人们对健康模式的需求。当前中国宠物犬的数量已经达到2 290万只，养狗的家庭占1.7%，是世界第三大宠物国。宠物犬和人类一样，对流感病毒是易感的，只是它们所感染的毒株与人类有所不同。当前已经发现宠物犬可以感染多种亚型，多种来源的流感病毒，包括禽源H3N2[2]、禽源H5N1[3]、禽源H5N2[4]、禽源H9N2[5]、禽源H10N8[6]和新型重组毒株流感病毒[7-8]。令人关注的是，通过血清学调查和体外试验证实，犬“承载”多种亚型的人流感，包括季节性H3N2亚型人流感、B型人流感病毒和2009年H1N1亚型甲型流感病毒[9-11]，这将对人类健康造成潜在的威胁。为了更好的预防和治疗犬流感病毒对宠物犬伤害，杜绝其中间传播宿主的作用，本研究开展对其临床流行病学的调查研究，全面分析了广西不同地区犬流感病毒对不同年龄、不同品种犬的感染和治疗情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的来源 2013年-2015年期间，采集广西11家宠物医院临床门诊中疑似呼吸道症状的宠物犬鼻拭子共765份，并将所采集样品进行编号，将其品种、性别、年龄、采集时间、临床症状及其治疗情况做了详细记录。采集地包括南宁、玉林、柳州、河池、百色、钦州、梧州、东兴、凭祥、桂林和北海等11个地级市。

1.1.2 主要试剂 细胞裂解液RNAiso plus、dNTP、AMV反转录酶、酶抑制剂购自宝生物工程(大连)有限公司；EasyTaqDNA polymerase购自全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中已知的M基因的保守序列设计扩增CIV特异片段的鉴定引物。上游引物F：5′-CTTCTAACCGAGGTCGAAACG-3′；下游引物R:5′-AGGG CATTTTGGACAAAKCGTCTA-3′(244 bp)。引物由上海杰李生物技术有限公司合成。

1.2.2 病料处理 用灭菌棉拭子涂搽有呼吸道症状宠物犬的鼻咽部，放入含有适量青、链霉素PBS液(pH7.2～7.6)中，漩涡振荡1 min后弃去棉拭子，8 000 r/min离心5 min，取上清液进行检测，剩余保存于-80℃备用。

1.2.3 RT-PCR鉴定 取200 μL鼻拭子上清液，按照病毒RNA抽提试剂盒说明提取病毒总RNA(Axygen)。用流感病毒反转录通用引物Uni-12(5′-AGCAAAAGC AGG-3′)，并按照AMV反转录酶使用说明书进行反转录合成cDNA。25 μL反转录体系为：5×buffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTP mix 2 μL，Uni 12 1 μL，M-MLV反转录酶 0.5 μL，RNasin抑制剂 0.5 μL，RNA 16 μL。加完后混匀并低速离心5 s，置PCR仪42℃反转录1 h。以病毒cDNA为模板，按照以下成分用量配制25 μL反应体系：premixTaq12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，H2O 8.5 μL，模板3 μL。置于PCR仪：95℃ 3 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。待PCR反应结束后，取10 μL PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳。设CIV细胞毒为阳性对照，ddH2O为阴性对照。

2 结果

2.1 2013年-2015年广西宠物CIVs检测结果

对2013年-2015年所收集的765份犬鼻拭子进行流感病毒M基因特异片段RT-PCR扩增，发现110份鼻拭子扩增可得到250 bp左右的特异条带，与预期的244 bp相符(图1)。犬流感样品阳性率为14.38%，超过10%阳性率的城市有6个，依次为钦州(40%)、梧州(34.29%)、凭祥(28.57%)、桂林(21.74%)、南宁(16.84%)和东兴(14.29%)；在玉林和百色两地尚未检测到阳性(图2)。结果表明，近几年来，广西多个地级市的CIV持续感染宠物犬群。

M.DNA标准DL 500; 1～2.样品RT-PCR产物；3.阳性对照；4.阴性对照

M.DNA Marker DL 500; 1-2.RT-PCR products of samples；3.Positive control; 4.Negative control

图1 宠物犬鼻拭子样品的RT-PCR检测

Fig.1 Detection of nasal swab from pet dogs by RT-PCR

图2 2013年-2015年广西区宠物犬流感病毒检测结果

2.2 不同生长阶段宠物犬CIV的感染情况

本研究将所采集的鼻拭子按宠物犬群的不同生长阶段来划分，分别为幼年(6个月龄以下)、青年(6月龄～2岁)、成年(2岁～7岁)和老年(7岁以上)。从宠物犬的品种、性别和生长阶段对3年来收集的91份阳性样品来源进行了分析。结果表明，不同品种、不同性别和不同年龄的宠物犬都可以感染流感病毒，但是感染程度不同，其中土狗感染后表现正常，其他品种(如阿拉斯加、拉布拉多、牧羊犬等)的临床症状表现较为严重。从宠物犬生长阶段分析发现，2013年-2015年间青年时期的宠物犬对流感病毒最为易感，其次是幼年和老年，2013年和2014年成年犬的感染程度相对较低，但是2015年成年犬的感染程度突然上升至25%(图3)。

3 讨论

随着社会人口老龄化的进一步加剧，伴侣动物在我国越来越普遍，促使了宠物行业的兴起，这将为CIV在人群与宠物群之间进行有效传播提供了时间和空间条件。因此，加强对宠物犬流感的防控和治疗，切断宠物群将流感病毒扩散到人群的中间途径

图3 宠物犬不同年龄阶段的CIVs感染情况

显得尤为重要。本研究的病原学调查发现，犬流感在2013年-2015年间在广西梧州、钦州和凭祥等多个城市呈地方流行态势，但是不排除其他尚未采样的城市也存在犬流感流行，尤其是犬猫疫苗普及率相对比较低的小县城和乡村，值得进一步调查了解。 临床调查发现，不同生长阶段犬群的CIV感染以幼年和青年犬群为主。原因分析可能有以下四方面：①幼犬期间常规传染病(犬瘟热，细小病毒病，冠状病毒感染，腺病毒感染等)免疫失败，动物整体免疫力不高，特别是当母源抗体逐渐下降，因此容易患犬流感；②饲养管理不当，比如食物和环境改变等应激因素的影响，导致其更容易患“感冒”或者继发其他感染；③接触患病宠物，或者宠物主人患感冒，间接传染给宠物；④青年犬有一定的抵抗力，即使感染CIV，也表现症状温和，经过治疗容易耐过，是病毒携带者或者主要潜伏群体。2015年调查发现，感染范围扩散到成年犬，犬感染率高达25%，病毒的进一步分离鉴定发现当前流感发生多样化重组，特别是与2009年甲型流感重组为新型流感病毒(数据未出示)，推断该新型病毒可能危害性更大。为了防护宠物犬免受病毒侵袭，我们应当在秋冬或者冬春交换季节，及时保温、提高幼犬的免疫能力、改善宠物的生活环境和卫生状况等措施。对于患病的犬只，良好的护理，并在此基础上进行整体治疗，根据病犬的具体病况对症下药是治疗病犬的最佳方案。目前，美国已经批准使用H3N8亚型犬流感灭活疫苗，用于犬流感的免疫预防，但是中国目前尚未使用任何犬流感疫苗。因此，制备一种安全有效、可对多种亚型流感病毒有交叉保护的犬流感疫苗将成为重要的研究课题。

综上所述，犬流感已在广西大部分地区呈地方流行，虽然临床上犬流感感染的症状较为温和，有些甚至并未出现较为明显的呼吸道症状，但是宠物犬与人类之间密不可分的关系，让我们不得不重视它在人与犬传播中的重要性。宠物医生在临床上及时的发现、确诊和治疗，并将主人发病的相关信息做好详细记录，将为研究跨宿主传播提供最有价值的资料。此外，宠物犬可作为“哨岗”来监测人流感的暴发，这在人类公共卫生方面具有重大意义。

致谢:本研究是柳州市鱼峰区华波宠物诊疗中心、南宁市华波宠物医院和广西大学预防兽医教研室共同努力完成。所得到的疑似呼吸道症状宠物犬鼻拭子样品均由柳州市华波宠物诊疗中心、南宁市华波宠物医院、南宁市惠康宠物诊所、梧州市玫瑰湖宠物店、北海市陆浩动物诊所、东兴市思维宠物、玉菊宠物诊所、南宁市十二叔宠物医院、玉林市101宠物医院、河池市动物疫病控制中心、南宁市小宝宠物医院、桂林名宠宠物医疗养护中心、钦州市宠乐康动物诊所、柳州至诚至宠宠物诊疗中心等11家宠物医院负责采集，在此一并致以衷心的感谢！

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Clinical Epidemiological Investigation of Canine Influenza in Guangxi from 2013 to 2015

ZHOU Hua-bo1,2, ZHAO Wei-feng1, HE Ping1, HUANG Xiao-wu3, YANG Wen-juan1, LI Rui-kai1, HE Jian-qiao1, XIE Ting4, WEI Zu-zhang1, HUANG Wei-jiang1, CHEN Ying1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning，Guangxi，530004，China; 2.HuaboPetHospital,Nanning,Guangxi，530004,China; 3.LiuzhouAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Liuzhou,Guangxi,545006,China; 4.HechiAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Hechi,Guangxi,547000,China)

In this study, the infection of canine influenza virus(CIV) in pet dogs from 11 cities of Guangxi were investigated from 2013 to 2015.It was found that the highest positive infection happened in Qinzhou which reached to 40%.Except for Baise and Yulin,the positive rates of the other cities ranged from 14.29% to 34.29%.Results showed that CIVs in pet dogs were common and endemic in Guangxi.Besides,the investigation for different species,gender and ages of pet dogs found that every kinds of pet dogs could be infected with CIVs.Pet dogs in youth phage(6 months-2 years old) were susceptible,the adult dogs(2-7 years old) also became potential susceptible population in 2015.Through the investigation of infection of CIVs,combined with clinical symptoms,it was better to guide the pet doctor to control the disease by effective measures and cut off the mediated ways of the transmission of influenza virus which will provide indirect help to prevent the outbreak of human pandemics.

pet dog; canine influenza virus; clinical epidemiology

2015-11-05

广西教育厅高校科学技术研究项目(YB2014005)；广西大学科研基金项目(XJZ140236)；广西自然科学基金回国项目(2015GXNSFCA139002);广西大学博士启动项目(XBZ160123)

周华波(1978-)，男，广西岑溪人，执业兽医师，硕士，主要从事宠物临床工作。*通讯作者

S852.655

B

1007-5038(2016)05-0122-04