电压依赖性钾通道在京尼平苷调控大鼠胰岛素分泌中的作用

刘云峰，丁亚琴，钟向琴，任乐乐，白 涛，，刘萌萌，章 毅



电压依赖性钾通道在京尼平苷调控大鼠胰岛素分泌中的作用

刘云峰1，丁亚琴2，钟向琴2，任乐乐2，白 涛1，2，刘萌萌2，章 毅2

目的 研究电压依赖性钾(Kv)通道在京尼平苷调控大鼠胰岛素分泌机制中的作用。方法 采用放免法检测大鼠胰岛组织的胰岛素分泌情况，膜片钳技术记录胰岛β细胞Kv电流和动作电位时程(APD)。结果 在8.3 mmol/L葡萄糖条件下，京尼平苷(0～100 μmol/L)可剂量依赖性地增加胰岛素分泌含量，在10 μmol/L时基本达最大促分泌效应，低糖(2.8 mmol/L)情况下则没有作用。膜片钳实验数据表明，京尼平苷剂量依赖性地(0～100 μmol/L)降低Kv通道电流密度，并在10 μmol/L的浓度下发挥最大抑制作用，并明显延长了动作电位时程。结论 京尼平苷在胰岛β细胞中通过抑制Kv、延长APD发挥促胰岛素分泌作用。

京尼平苷；胰岛素分泌；电压依赖性钾通道；动作电位

随着人类环境、饮食习惯等变化，糖尿病因其高发病率及高危害性在世界范围内已成为一个日益严重的公共卫生问题。2013年一项流行病学调查显示，中国成人糖尿病患病率已高达11.6%，约1.14亿糖尿病病人[1]，研究能延缓或者治疗糖尿病的药物刻不容缓。临床上使用的促胰岛素分泌剂在长期用药过程中易引发低血糖等不良反应[2]，因此研发具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌药物对治疗糖尿病有重要意义。京尼平苷(geniposide，GP)又名栀子苷，是一种环烯醚萜类化合物，主要存在于栀子、杜仲等植物中，具有抗炎、保肝[3]、抗糖尿病[4]等作用，近年来因其调节胰岛素分泌作用被大家广泛认识并加以研究。然而，京尼平苷调控胰岛素分泌的机制仍然不明确，因此本课题将采用膜片钳技术对电压依刺性钾(Kv)通道在调控胰岛素分泌中所发挥的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料及主要仪器 雄性Wistar大鼠(北京动物中心提供)，体重200 g～250 g。胶原酶 P(瑞士Roche)、BSA(加拿大BBI Life Science)、青链霉素(北京索莱宝公司)、Histopaque 1077(美国Sigma公司)、1640培养基(武汉博士德公司)、DispaseⅡ( 美国 Amresco)，大鼠胰岛素放射免疫试剂盒(北京北方生物技术公司)；EPC 10 全自动膜片钳(德国 HEKA)；细胞培养箱(北京博奥恒信生物科技有限公司)；台式离心机(长沙湘仪仪器有限公司)；Narishige MODEL PP830 电极拉制仪、MIROFORGE MF830 抛光仪(日本 Narishige)。

1.2 方法

1.2.1 胰岛、胰岛细胞的分离及培养 大鼠处死，剪开腹部，暴露胰腺及胆管，从胆总管将1 mg/mL胶原酶P注入胰腺组织，水浴消化11 min，经Histopaque 1077梯度离心，体视显微镜下挑取分离纯化后的胰岛。分离所得胰岛置于含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素的1640培养基中，37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养[5]。胰岛经DispaseⅡ消化可得到单个胰岛细胞。

1.2.2 胰岛素分泌实验 配制KRBH孵育液，依实验要求进行实验分组，分别添加不同浓度的葡萄糖和京尼平苷，所有分组在药物干预前用含2.8 mmol/L葡萄糖的KRBH液孵育30 min，然后依次加入不同浓度葡萄糖及药物，培养箱中孵育30 min，收集上清，用放免法检测胰岛素分泌量。

1.2.3 膜片钳技术 记录Kv电流时，将细胞与电极形成稳定的GΩ封接，钳制细胞于-70 mV，每10 mV一个步接，给予-70 mV～80 mV的电压刺激，在全细胞模式下破膜，记录400 ms内的电流变化。记录动作电位时程(APD)时，细胞封接、破膜后，调为电流钳模式，注入150 pA、4 ms的电流，计算从去极化开始到复极化至静息电位上10 mV的电流时长。细胞电容大于7pF被认为是β细胞[6]。

2 结 果

2.1 京尼平苷对胰岛素分泌的影响 在较低葡萄糖浓度(2.8 mmol/L)时，京尼平苷对胰岛素分泌无明显影响；在较高葡萄糖浓度(8.3 mmol/L)时，京尼平苷对胰岛素分泌的调节呈浓度依赖性，且在10 μmol/L时基本达最大分泌量。详见表1。

表1 不同浓度京尼平苷对 胰岛素分泌的影响(±s) μIU/mL

2.2 京尼平苷对胰岛β细胞Kv电流的影响 采用全细胞膜片钳技术，检测不同浓度的京尼平苷 (1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L) 对Kv电流的影响。本实验所用细胞外液的葡萄糖浓度为11.1 mmol/L，可阻断KATP通道的电流，排除了KATP对Kv电流的影响。在 80 mV电流刺激时，京尼平苷与对照组相比明显地抑制了 Kv电流，且呈浓度依赖性。详见表2。

表2 京尼平苷对电压依赖性钾通道的影响(±s)

2.3 Kv阻断剂(TEA)对京尼平苷调节胰岛素分泌的影响 Kv阻断剂TEA可明显抑制Kv电流。与2.8 mmol/L葡萄糖相比，8.3 mmol/L葡萄糖明显促进了胰岛素分泌(P<0.05)；在8.3 mmol/L葡萄糖条件下，给予京尼平苷和TEA均促进了胰岛素分泌，与8.3 mmol/L葡萄糖相比，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3、表4。

表3 TEA对Kv的抑制作用(±s)

表4 Kv阻断剂对京尼平苷调节胰岛素分泌的影响(±s)

2.4 京尼平苷对动作电位的影响 京尼平苷干预后与对照组相比，动作电位时程明显延长(P<0.01)。详见表5。

表5 京尼平苷对动作电位的影响(±s) ms

3 讨 论

越来越多的证据表明：京尼平苷具有抗糖尿病的作用[7-8]。有报道称，在链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病(T2DM)大鼠模型中，京尼平苷可降低血糖浓度、提高外周胰岛素水平、改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用[9]。本研究证实：不同浓度的京尼平苷在低浓度葡萄糖(2.8 mmol/L)条件下对胰岛素分泌无作用，而在8.3 mmol/L条件下可浓度依赖性的增加胰岛素分泌量，且10 μmol/L时基本达最佳促泌效应。

在胰岛β细胞中，阻断Kv通道电流可延长动作电位进而产生促胰岛素分泌的作用[10-11]。从膜片钳所测结果可看出，随着京尼平苷浓度的增加Kv电流呈逐渐抑制的趋势，且在10 μmol/L时可基本达到最大抑制效果，而且本研究也表明京尼平苷显著延长了动作电位时程。因此，认为京尼平苷通过阻断Kv电流、延长动作电位，进而产生促胰岛素分泌作用。TEA是常用的Kv阻断剂。本实验表明：TEA可极大地抑制Kv电流，在8.3 mmol/L葡萄糖条件下，TEA(20 mmol/L)可明显促进胰岛素分泌。然而，在同时使用TEA和京尼平苷孵育胰岛时，其分泌量(9.22±0.89)高于单独用TEA孵育所产生的胰岛素分泌量(5.92±0.74)，即TEA并未完全减弱京尼平苷的促分泌作用。分析原因可能是京尼平苷调控胰岛素分泌的过程不仅有电压依赖性钾通道参与，还有其他因素，诸如钙离子通道等，对此将进一步深入地探索。

综上所述，本研究证明京尼平苷在大鼠胰岛β细胞中通过抑制Kv通道、延长动作电位时程发挥促胰岛素分泌作用，即Kv通道在京尼平苷调控胰岛素分泌作用中扮演重要角色，为深入理解京尼平苷抗糖尿病的机制提供了理论依据。

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(本文编辑郭怀印)

The Role of Voltage-dependent Potassium Channel in Geniposide-induced Insulin Secretion in Rats

Liu Yunfeng，Ding Yaqin，Zhong Xiangqin，Ren Lele，Bai Tao，Liu Mengmeng，Zhang Yi

The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Zhang Yi (Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China)

Objective To explore the role of voltage-dependent potassium (Kv) channel in the mechanism of geniposide-induced insulin secretion in rats. Methods We evaluated the direct effects of geniposide on β-cell function using rat pancreatic islets and dispersed single cells. Patch β-clamp recordings were applied to measure Kv channels，action potential duration (APD). The level of insulin secretion and the content of cyclic AMP in the culture medium were measured with radioimmunoassay. Results Geniposide (0 to 100 μmol/L) potentiated insulin secretion from pancreatic islets in a dose-dependent manner under 8.3 mmol/L glucose conditions but not 2.8 mmol/L，and a maximal increase was observed when islets were exposed to geniposide at a concentration of 10 μmol/L. The current-voltage relationship curve obtained in patch-clamp experiments demonstrated that geniposide (0 to 100 μmol/L) dose-dependently decreased the current densities through Kv channels and exerted a maximal inhibitory effect at the concentration of 10 μmol/L.What’s more，we detected that geniposide significantly prolonged APD. Conclusion Geniposide can promote insulin secretion by inhibiting Kv and prolonging APD in islet β cells.

geniposide；insulin secretion；voltage-dependent potassium channel；action potential duration

国家自然科学基金(No.81273564，81373464，81670710)；山西省留学回国人员科技活动项目择优资助(No.2016-97)

1.山西医科大学第一医院(太原030001)；2.山西医科大学

章毅，E-mail：yizhang313@163.com

R335

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.011

1672-1349(2016)22-2626-03

2016-09-04)

引用信息：刘云峰，丁亚琴，钟向琴，等.电压依赖性钾通道在京尼平苷调控大鼠胰岛素分泌中的作用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(22)：2626-2628.