PI3K/AKT/GSK3-b信号转导通路在红景天苷保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制

2017-01-04 08:42
中西医结合心脑血管病杂志 2016年22期
关键词:蛋白激酶红景天激酶

李 佳



PI3K/AKT/GSK3-b信号转导通路在红景天苷保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制

李 佳

目的 研究磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合酶激酶-3b(PI3K/AKT/GSK3-b)信号传导通路在红景天苷保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制。方法 健康雄性清洁级SD大鼠,结扎大鼠左冠状动脉前降支,复制心肌缺血再灌注损伤(I/R)模型,随机分为6组:假手术组(Sham)、心肌缺血-再灌注模型组(I/R)、红景天苷预防组(红景天苷+缺血再灌注,S+I/R)、红景天苷治疗组(缺血再灌注+红景天苷,I/R+S)、红景天苷预防组+P13K特异性抑制剂LY294002组(S+I/R+LY组)、红景天苷治疗组+P13K特异性抑制剂LY294002组(I/R+S+LY组),每组6只。采用免疫细胞化学法检测细胞内丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)、AKT磷酸化(p-AKT)、糖原合酶激酶(GSK3-b)、GSK3-b磷酸化(p-GSK3-b)的表达,Western Blot检测细胞内p-AKT、p-GSK3-b蛋白表达。结果 免疫细胞化学法和Western Blot结果显示:与 I/R组相比,红景天苷预防组、治疗组大鼠心肌组织中AKT、GSK3-b的磷酸化激活程度显著升高(P<0.05),红景天苷预防组和治疗组组间AKT、GSK3-b磷酸化状态比较,差异无统计学意义(P>0.05),此变化被PI3K特异性抑制剂LY294002部分阻断(P<0.05);I/R组与Sham组相比,AKT、GSK3-b磷酸化蛋白表达略增加,两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 红景天苷对大鼠心肌缺血-再灌注损伤具有显著的保护作用,推测其可能机制主要与激活PI3K/AKT/GSK3-b信号通路等因素有关。

心肌缺血-再灌注损伤;红景天苷;磷脂酰肌醇-3激酶;丝氨酸;糖原合酶激酶-3b

磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合酶激酶-3b(PI3K/AKT/GSK3-b)是细胞内重要的信号转导通路,在细胞的凋亡、存活以及增殖等活动中发挥重要的生物学功能。2004年Hausenloy等[1]首次提出再灌注损伤激酶(RISK)信号通路,是一组促细胞存活的蛋白激酶,包括PI3K-AKT 和细胞外调节蛋白激酶(Erk),它们在再灌注的几分钟内激活,能够减轻心肌缺血再灌注损伤(MIRI),是调节细胞存活的关键通路。多种生长因子、癌蛋白和生存因子能引起受体酪氨酸的磷酸化,激活 PI3K 形成磷酸化肌醇磷脂产物PIP3,PIP3作为第二信使将细胞外信号传递给PI3K下游的靶蛋白发挥生物学效应,丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)的磷酸化过程就是其中之一。活化的AKT具有抗心肌缺血缺氧、抗心肌细胞凋亡等作用。继而使之脱离质膜,进入细胞质和细胞核中,调节糖原合酶激酶(GSK3-b)、p70S6蛋白激酶(p70S6K)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及抗凋亡因子 Bcl-2 等的表达[2-4]产生心肌保护作用。Wu 等[5]研究发现:舒芬太尼药物后处理可以缩小心肌梗死面积,同时观察到药物后处理组AKT、GSK3-b磷酸化水平增高,PI3K 抑制剂可消除舒芬太尼药物后处理的心肌保护作用,推测其通过PI3K/AKT/GSK-3b信号通路发挥心脏保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性清洁级SD大鼠,体重240 g±10 g,由南京军区南京总医院实验动物中心提供。全部大鼠分笼标准饲料饲养,自由摄食和饮水,在一定湿度(60%)和室温(25 ℃)的空间内适应性喂养 1周。

1.2 实验材料 红景天苷20 mg:HPLC检测纯度≥98%,南京奥多福尼生物科技有限公司;10%水合氯醛、10%甲醛溶液,0.9%氯化钠注射液,双蒸水:南京军区南京总医院制剂科提供;AKT抗体:购自美国CST公司(货号:#4685);p-AKT抗体:购自美国CST公司(货号:#2965);GS3K-b抗体:购自美国CST公司(货号:#9315);p-GS3K-b抗体:购自美国CST公司(货号:#9322);PI3K抑制剂LY294002:购自美国CST公司(货号:#9901);DAB Kit :中国福州迈新生物科技有限公司DAB-1031;苏木素染色液:南京建成生物工程研究所D005。

1.3 实验仪器 HX-100E小动物呼吸机:成都泰盟科技有限公司;12导自动分析心电图机:北京福田电子医疗仪器有限公司;超低温保存箱:中国海尔公司BCD-258A/C;数显恒温水浴锅(型号:HH-1):金坛瑞尔电器有限公司;生物倒置显微镜:日本Olympus IX51;Image-Pro Plus 6.0 软件:美国 Media Cybernetics公司。

1.4 方法

1.4.1 分组方法 雄性清洁级SD大鼠,体重240 g±10 g。将全部大鼠编号,采用数字化随机分组:假手术组(Sham)、心肌缺血再灌注模型组(I/R)、红景天苷预防组(红景天苷+缺血再灌注,S+I/R)、红景天苷治疗组(缺血再灌注+红景天苷,I/R+S)、红景天苷预防组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(S+I/R+LY组)、红景天苷治疗组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(I/R+S+LY组),每组6只。饲养于恒温净化通风动物房,自由进食与饮水。

1.4.2 模型制备方法 大鼠称重240 g±10 g,按文献[6]复制模型,以10%水合氯酸(0.32 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,将大鼠仰卧位固定于鼠板,针状电极穿刺四肢皮下接心电图机心电监护,在50 W灯泡颈部照射下,将大鼠舌头拉出,以防舌根后坠。颈部及左胸备皮,颈前正中纵向剪开大鼠皮肤(长约2 cm),充分暴露气管,分离出气管,于气管软骨间隙中横向切开气管壁,右手持16G静脉留置针套管迅速插入,后拔出管芯,气管插管连接小动物呼吸机,辅助呼吸参数为:呼吸频率80次/min~100次/min,潮气量3 mL/kg,呼吸比为5∶2。于大鼠胸骨左缘第3、4助间,距胸骨左缘0.5 cm处依次切开皮肤、浅筋膜、深筋膜,用血管钳钝性分离胸大肌及前锯肌,逐步剪开肋间肌,用自制拉钩牵开胸廓,注意用棉球保护肺叶以免肺出血,小心打开心包,充分暴露心脏。于肺动脉圆锥和左心耳之间,以左冠状静脉主干为标志,用棉签挑起左心耳,并于其根部下方3 mm~5 mm处进针,使用5/0缝合线,进针深度0.5 mm左右,宽度2 mm左右。并联合冠脉充气球囊一同结扎左冠状动脉前降支(LAD)。清除胸腔内积血,暂时关闭胸腔。假手术组仅在左冠状动脉穿线不结扎,直接关胸。结扎成功的标志为:心电图标准导联上ST段上抬、QRS波出现形似左束支传导阻滞样的宽大畸形,左室前壁局部颜色苍白或发绀。结扎30 min后,松开球囊开始再灌注。冠脉再通的标志为:抬高的ST段下降50%以上,QRS波幅变窄而低,缺血区心肌苍白或发绀色转为红润。关闭呼吸机,拔出导管,加压缝合气管周围肌肉及皮肤。并将大鼠置于恒温下待其苏醒。

1.4.3 给药方法 红景天苷预防组和预防组+LY组在造模前连续给药3 d,1次/日,红景天苷12 mg/kg腹腔注射;红景天苷治疗组和治疗+LY组在再灌注即刻加予红景天苷12 mg/kg腹腔注射,Sham组和I/R组均给予等量的生理盐水腹腔注射。红景天苷预防+LY组和红景天苷治疗+LY组于术前10 min给予腹腔注射磷脂酰肌醇3激酶特异性抑制剂LY294002(溶于DMSO)0.3 mg/(kg·d)。

1.4.4 蛋白表达检测及磷酸化状态 采用改良RIPA缓冲液提取心肌组织中蛋白质,BCA比色法测定所提取蛋白的浓度。分离胶12%,浓缩胶5%,按照SDS-PAGE试剂盒说明书配方依次加入制备试剂。将样品用微量加样器按一定顺序加到孔内。电流20 mA,电压70 V,130 min,电泳至溴酚蓝刚跑出凝胶底部时即可终止电泳。恒压70 V转移至PVDF膜。转膜结束后,取出膜放入培养皿中,加封闭液,37 ℃温育1.5 h。封闭结束后取出膜TBST洗3次×5 min,用封闭液按比例稀释一抗(1∶1 000)后敷一抗,4 ℃过夜。将膜取出封闭液3次×5 min,TBST洗3次×5 min,滤纸吸干,PBS稀释二抗(1∶2 500),37 ℃温育1 h。封闭液3次×5 min,TBST洗3次×5 min,滤纸吸干,应用显影定影法显像。

2 结 果

2.1 完成实验情况 本实验共用大鼠44只,预实验8只,在制备模型过程中,有4只大鼠因建模失败剔除(气管插管失败1只,结扎后即刻出现室颤死亡1只,缺血期间发生无法纠正的恶性心律失常死亡1只,拔出气管插管后死亡1只)。

2.2 心肌组织AKT磷酸化状态 Sham组大鼠心肌组织AKT的磷酸化水平很低,I/R组与Sham组相比,AKT磷酸化(pAKT)蛋白表达略增加,这可能是大鼠自身的保护性反馈作用,两组差异无统计学意义。缺血再灌注后,与 I/R组(p-AKT/AKT 0.56±0.09)相比,红景天苷预防组(p-AKT/AKT0.86±0.12)、治疗组(p-AKT/AKT 0.73±0.11)大鼠心肌组织中AKT的磷酸化激活程度显著升高。红景天苷预防组和红景天苷治疗组间AKT磷酸化状态比较,差异无统计学意义(P>0.05)。而这种激活程度的上升可以被PI3K特异性抑制剂LY294002阻断,表现为红景天苷预防+LY组(p-AKT/AKT 0.27±0.07)、红景天苷治疗+LY组(p-AKT/AKT 0.36±0.11)AKT磷酸化水平显著降低(P<0.05)。详见图1、图2。

图1 各组梗死区心肌组织 AKT蛋白表达的代表性条带

注:与手术组比较,*P<0.05;与预防组+LY比较,

#P<0.05;与治疗组+LY比较,∧P<0.05。

图2 各组梗死区心肌组织 AKT蛋白表达

2.3 各组心肌组织GSK3-b磷酸化状态 Sham组大鼠心肌组织GSK3-b的磷酸化水平很低,I/R组与Sham组相比,GSK3-b磷酸化(p-GSK3-b)蛋白表达略增加,这可能是大鼠自身的保护性反馈作用,两组 差异无统计学意义;缺血再灌注后,与 I/R组(p-GSK3-b/GSK3-b 0.47±0.07)相比,红景天苷预 防组(p-GSK3-b/GSK3-b 0.97±0.07)、治疗组(p-GSK3-b/GSK3-b 0.91±0.13)大鼠心肌组织中GSK3-b 的磷酸化激活程度显著升高。红景天苷预防组和红景天苷治疗组比较,GSK3-b磷酸化水平差异无统计学意义(P>0.05)。应用PI3K抑制剂LY294002后,红景天苷对GSK3-b的激活明显被抑制,表现为红景天苷预防+LY组(p-GSK3-b/GSK3-b 0.21±0.07)、红景天苷治疗+LY组(p-GSK3-b/GSK3-b 0.30±0.05)GSK3-b磷酸化水平显著降低(P<0.05)。详见图3、图4。

图3 各组梗死区心肌组织 GSK3-b蛋白表达的代表性条带

注:与手术组比较,*P<0.05;与预防组+LY比较,#P<0.05;与治疗组+LY比较,∧P<0.05。

图4 各组梗死区心肌组织 GSK3-b蛋白表达

3 讨 论

PI3K/AKT/GSK3-b信号通路是经典的再灌注损伤挽救激酶信号通路(RISK)之一,具有很多保护性的调控作用,如调节糖原合成、减少细胞凋亡、调控葡萄

糖的转运等。Tisser等研究发现,植物雌激素药物能够减轻兔心肌缺血再灌注损伤,且可以观察到AKT磷酸化增加{6]。随着研究的不断深入,大量实验研究报道很多药物可以通过激活RISK进而发挥心肌保护作用。RISK信号通路的激活主要表现为相关靶点的磷酸化,如PI3K,AKT和GSK3-b的磷酸化。本实验结果显示:红景天苷预处理、后处理可激活 RISK 通路,使AKT、GSK3-b磷酸化状态增多,发挥心肌保护作用。同时,预处理、后处理在AKT、GSK3-b磷酸化水平上无显著差异,表明二者激活 RISK 通路作用类似,均是有效减轻MIRI的途径。为了进一步证明红景天苷经 PI3K/AKT/GSK3-b通路发挥作用,选择了PI3K的特异性抑制剂 LY294002进行实验。结果显示治疗+LY 组和红景天苷预防+LY组的AKT、GSK3-b磷酸化水平较红景天苷预防组和治疗组显著降低,且与I/R组比较埋头差异无统计学意义,表明PI3K信号通路被抑制,AKT、GSK3-b的磷酸化受限,红景天苷的心肌保护作用消失。

综上所述,红景天苷对大鼠心肌缺血-再灌注损伤具有显著的保护作用,由研究结果推测,其可能的作用机制与增加GSK3-b、AKT磷酸化蛋白表达,激活PI3K/AKT/GSK3-b信号通路等因素有关。当然本研究仍存在不足,如时间关系及实验条件限制,仅对红景天苷抗MIRI的分子生物学机制做了初步探讨,希望从PI3K/AKT/GSK3-b信号转导通路的上游及下游的相关通路入手,进行更深入的研究,为临床应用提供更丰富的理论依据。

[1] Hausenloy DJ,Yellon DM.New directions for protecting the heart against ischecmia- reperfusion injury:targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway[J].Cardiovasc Res,2004,61(3):448-460.

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[4] 方军,吴黎明,陈良龙.RISK 信号通路在心肌预处理及后处理中的作用[J].中国病理生理杂志,2009,25(10):2062-2067.

[5] Wu QL,Shen T,Ma H,et al.Sufentanil postconditioning protects the myocardium from ischemia-reperfusion via PI3K/Akt-GSK-3 beta pathway[J].J Surg Res,2012,178 (2):563-570.

[6] 王加林,曹勇,罗正义.大株红景天注射液治疗冠心病心绞痛疗效观察[J].现代中西医结合杂志,2010,19(16):1978-1979.

(本文编辑郭怀印)

江苏省常州市德安医院(江苏常州 213000),E-mail:609234006@qq.com

引用信息:李佳.PI3K/AKT/GSK3-b信号转导通路在红景天苷保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制[J].中西医结合心脑血管病杂志,2016,14(22):2621-2624.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.009

1672-1349(2016)22-2621-04

2016-03-21)

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