1型1-磷酸鞘氨醇受体的siRNA对人涎腺导管上皮细胞的作用

李 琼，常志芳，杨国安，庞春艳,，王永福,△

(1. 包头医学院第一附属医院风湿免疫科，内蒙古自治区包头 014010； 2. 内蒙古自治区自体免疫学重点实验室, 内蒙古自治区包头 014010)



·论著·

1型1-磷酸鞘氨醇受体的siRNA对人涎腺导管上皮细胞的作用

李 琼1，常志芳1，杨国安2，庞春艳1,2，王永福1,2△

(1. 包头医学院第一附属医院风湿免疫科，内蒙古自治区包头 014010； 2. 内蒙古自治区自体免疫学重点实验室, 内蒙古自治区包头 014010)

目的：构建靶向1型1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine 1-phosphate receptor-1,S1P1)基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)慢病毒表达载体，感染干燥综合征细胞模型——人涎腺导管上皮细胞(human salivary gland cells，HSG)，探讨S1P1的siRNA治疗干燥综合征的可能性，为临床靶标治疗提供广阔的思路。方法：实验分空白组、空载体组、scramble-siRNA组及S1P1-siRNA组，分别将pLL3.7空载体、构建成功的scramble-siRNA及S1P1-siRNA慢病毒表达载体与pMD2.G、pMDL g/p RRE、pRSV-REV共转染293T细胞制备病毒，感染HSG细胞株48 h，流式细胞术检测其感染效率，实时荧光定量RT-PCR法检测HSG细胞中S1P1 mRNA的表达水平，细胞免疫组织化学法检测细胞中S1P1蛋白的表达水平，ELISA法检测细胞上清中γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)和白细胞介素(interleukin，IL)-17的表达水平。结果：(1)成功构建scramble-siRNA、S1P1-siRNA慢病毒表达载体，慢病毒的滴度约为3.5×108TU/mL。(2)感染48 h后S1P1-siRNA组HSG细胞中S1P1 mRNA的表达水平明显低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)S1P1-siRNA组HSG细胞中S1P1蛋白的表达水平低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组，差异有统计学意义(P<0.05)。(4)S1P1-siRNA组HSG细胞分泌的IL-17的浓度明显降低，与空白组、空载体组和scramble-siRNA组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(5)S1P1-siRNA组细胞上清液中IFN-γ的浓度降低，与空白组、空载体组和scramble-siRNA组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：成功构建了靶向S1P1基因的慢病毒载体，S1P1 siRNA可以使S1P1 mRNA和蛋白表达水平下降，细胞上清液中IL-17和IFN-γ的浓度下降，证明S1P1 siRNA可转染HSG细胞且特异、高效地抑制S1P1基因的表达，抑制细胞上清液中细胞因子的表达，为治疗干燥综合征奠定了实验基础。

受体, 鞘磷脂；RNA，小分子干扰；涎腺；腺泡细胞；遗传载体

干燥综合征(Sjögren’s syndrome，SS)是一种侵犯外分泌腺体(以泪腺、唾液腺为主)、具有高度淋巴细胞浸润的弥漫性结缔组织病，临床主要表现为眼干、口干等症状[1]。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是公认的细胞内信使和细胞外介质，其作为第一信使与细胞膜上相应的S1P受体相互作用调节免疫功能，在自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。位于细胞膜上的S1P受体属于G蛋白偶联受体(guanosine-binding protein coupled receptor，GPCR)家族，分别为1～5型S1P受体(S1P1～S1P5)，不同受体在不同时间的表达激活会发生不同的生物学效应。S1P1是淋巴细胞的重要受体，与淋巴细胞的再循环相关，其成为很多疾病的治疗靶标。S1P/S1P1信号参与多发性硬化症[2]、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎[3]、SS[4]等自身免疫性疾病的发生、发展。

人涎腺导管上皮细胞(human salivary gland cells，HSG)来源于一位口底癌患者的颌下腺，该患者经过放射治疗后取出颌下腺，病理检查未见癌变，经过原代培养、筛选、克隆出了HSG细胞，它与涎腺的发生和生长有一定的关系，常被用来研究SS。本研究采用慢病毒介导的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术沉默HSG细胞中S1P1基因的表达，探讨S1P1基因的siRNA对HSG细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司，实时荧光PCR仪Line Gene 9640购自BIOER公司，流式细胞仪购自BD公司，载体PLL3.7购自美国Origene公司，pMD2.G、pMDL g/p RRE、pRSV-REV购自美国Addgene公司，AxyPrep质粒DNA大量抽提试剂盒购自美国Axygen公司，lipofectamineTM2000、二抗购自美国Invotrigen公司，一抗购自英国Abcam公司，ELISA试剂盒(RD国内分装试剂盒)购自上海生物工程有限责任公司。

1.2 siRNA的设计

本实验根据Elbashir的设计原则，并参考在线siRNA靶点设计软件(http：//www.ambion.com/techlib/mis/siRNA-finder.html)确定靶序列。针对S1P1基因的cDNA序列设计1段siRNA，序列为：CGCGGACTAGGAGAACAGGAACAAA，同时设计1段scramble siRNA，序列为：CGCGGACAAGGAGAACAGCATTAAA。将上述序列插入经HpaⅠ、XhoⅠ双酶切后的质粒载体pLL3.7中，转化感受态大肠杆菌，阳性克隆送Invotrigen公司进行DNA基因测序分析鉴定慢病毒表达载体是否构建成功。

1.3 慢病毒的包装和滴度测定

慢病毒包装前1天，将处于对数生长期的293T细胞调整为6×106/mL接种在60 mm的细胞培养皿中，37 ℃、5%(体积分数)CO2孵育箱内完全培养液培养24 h。将空载体pLL3.7、慢病毒载体pLL3.7-S1P1-siRNA(30 μL)及pLL3.7-S1P1-scramble-siRNA分别与辅助载体pMD2.G(15 μL)、pMDL g/p RRE(15 μL)和pRSV-REV(15 μL)以体积比为2 ∶1 ∶1 ∶1的比例共转染293T细胞生产病毒，12 h后换完全培养液，48 h后收集病毒液，-80 ℃冰箱保存。

1.4 慢病毒感染HSG细胞

将HSG细胞以1×105/mL接种于24孔板，每孔400 μL，接种24 h后，加polybrene进行慢病毒第1次感染，24 h后进行慢病毒第2次感染，再24 h后换完全培养液。感染后48 h，倒置显微镜明视野和荧光视野下观察病毒感染情况，同时用流式细胞仪检测感染效率。

1.5 实验分组及各项指标检测

实验分为空白组、空载体组、scramble-siRNA组和S1P1-siRNA 4组，将成功构建的scramble-siRNA、S1P1-siRNA慢病毒表达载体及空载体分别转染293T细胞，制备病毒，之后将含有scramble-siRNA、S1P1-siRNA和空载体的病毒液分别感染HSG细胞。感染48 h后，在倒置显微镜明视野和荧光视野下观察细胞感染情况,同时使用BD公司的流式细胞仪检测慢病毒感染HSG细胞的效率。TRIzol法提取细胞总RNA，使用Takara公司的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，实时荧光定量RT-PCR法检测细胞中S1P1 mRNA的表达，并根据Ct值计算2-ΔΔCt，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。S1P1上游引物：5′-AGGGAGTATGTTTGTGGC-3′，下游引物：5′-AGAGGCGGAAGTTATTGC-3′；内参β-actin上游引物：5′-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3′，下游引物：5′-TGATTTTGGAGGGATC-TCGC-3′。同时，4组细胞做荧光免疫组织化学染色，图片采用IPP6软件分析平均光密度(D)值。ELISA检测细胞上清液中细胞因子IFN-γ和IL-17的变化，测定在450 nm波长处的D值，根据标准曲线计算出IFN-γ和IL-17的浓度。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 测序结果

构建的S1P1-siRNA慢病毒表达载体送Invitrogen公司进行DNA基因测序分析，测序结果显示S1P1-siRNA表达序列及scramble序列已完整无误地插入质粒载体pLL3.7中(图1)。

A, scramble-siRNA group; B, S1P1-siRNA group. S1P1, sphingosine 1-phosphate receptor-1; siRNA, small interfering RNA.

图1 S1P1-siRNA慢病毒表达基因测序图

Figure1 Gene sequecing pattern of the S1P1-siRNA lentiviral vector

2.2 慢病毒滴度的滴定

将pLL3.7空载体和构建成功的scramble-siRNA及S1P1-siRNA慢病毒表达载体分别与辅助载体pMD2.G、pMDL g/p RRE和pRSV-REV共转染293T细胞制备病毒，病毒感染293T细胞经流式细胞术鉴定，病毒的滴度为3.5×108TU/mL。

2.3 慢病毒感染HSG细胞的效率

慢病毒感染HSG细胞48 h后，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光，说明慢病毒可以高效地感染HSG细胞(图2)。

将上述在荧光显微镜下观察后的细胞进行胰酶消化并收集，流式细胞仪分析慢病毒感染HSG细胞的感染效率，结果显示空载体、scramble-siRNA及S1P1-siRNA组的感染效率依次为55.6%、54.0%、50.6%(图3)，感染效率均在50%以上,可以进行后续的实验。

HSG, human salivary gland cells; S1P1, sphingosine 1-phosphate receptor-1; siRNA, small interfering RNA.

图2 HSG细胞感染效率(×200)

Figure2 HSG cell infection efficiency(×200)

2.4 慢病毒感染后HSG细胞中S1P1 mRNA的表达水平

HSG细胞感染后，S1P1-siRNA组细胞中S1P1 mRNA的表达水平明显低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组(P<0.01)，空白组、空载体组和scramble-siRNA组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 4组HSG细胞中S1P1 mRNA表达水平

*P<0.01, compared with the other three groups. Abbreviations as in Figure 2.

2.5 慢病毒感染后HSG细胞中S1P1蛋白的表达水平

慢病毒感染HSG细胞后，S1P1-siRNA组的红色荧光弱于空白组、空载体组和scramble-siRNA组(P<0.05)，空白组、空载体组和scramble-siRNA组间比较差异无统计学意义(P>0.05，图4)。将上述各组细胞收集，经流式细胞术分析结果显示，S1P1-siRNA组细胞S1P1蛋白的表达低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组(P<0.05)，空白组、空载体组和scramble-siRNA组间比较差异无统计学意义(P>0.05，图5)。

2.6 慢病毒感染后细胞上清液中IFN-γ和IL-17的表达水平

慢病毒感染HSG细胞后，S1P1-siRNA组细胞上清液中IFN-γ和IL-17的水平明显低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组(P<0.05)，空白组、空载体组和scramble-siRNA组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

A, blank group; B, empty vector group; C, scramble-siRNA group; D, S1P1-siRNA group. Abbreviations as in Figure 2.

图3 流式细胞仪检测HSG细胞感染效率

Figure3 HSG cell infection efficiency was analysis by flow cytometry

A, blank group; B, empty vector group; C, scramble-siRNA group; D, S1P1-siRNA group. Abbreviations as in Figure 2.

图4 免疫荧光检测HSG细胞中S1P1蛋白的表达水平

Figure4 Expression levels of S1P1 protein in HSG by immunofluorescence assay cells

3 讨论

SS是一种全身性自身免疫性疾病，其特点是外分泌腺的慢性炎症导致组织损伤和分泌功能障碍[5-6]，临床主要表现为黏膜干燥，其确切发病机制仍不明，大多研究者认为是多因素相互作用最终导致免疫功能紊乱，从而引起机体细胞免疫和体液免疫的异常反应，并进一步通过各种细胞因子和炎症介质造成组织损伤。目前，SS尚无根治方法，主要使用糖皮质激素和免疫抑制剂等药物对症积极治疗，因此，我们需要研究和寻找更为确切、有效的治疗手段。

Abbreviations as in Figure 2.

图5 HSG细胞中S1P1蛋白的表达水平

Figure5 Expression levels of S1P1 protein in HSG cells

S1P以μmol/L至nmol/L的相对较高的浓度存在于血液和淋巴循环中[7]，是一种独特的细胞信号分子，具有生物学活性，可通过作用于细胞表面的S1P受体(S1P1～S1P5)激活一系列下游信号通路发挥生物学功能，也可以作为第二信使，直接作用于胞内靶标。很多研究表明，S1P/S1P1信号与自身免疫性疾病密切相关。在免疫系统中，S1P与未成熟的和记忆T细胞膜上的S1P受体相互作用，调节T淋巴细胞的发育。S1P1与全身各处淋巴细胞再循环密切相关，淋巴细胞表面S1P1的表达调节淋巴细胞归巢和从次级淋巴器官进入血液。S1P1的激活导致细胞类型特异性应答，包括细胞迁移、侵袭、增殖及血管新生，也引起一些病理过程，如自身免疫性疾病、炎症[7]。

表2 4组细胞上清液中IFN-γ和IL-17表达水平

*P=0.01, compared with the other three groups. IFN-γ, interfe-ron-γ; IL-17, interleukin-17; other abbreviations as in Figure 2.

最早被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的小分子药物芬戈莫德(fingolimod，FTY720)为S1P受体拮抗剂，使淋巴细胞表面的S1P1长时间内化，造成淋巴细胞表面暂时性低S1P1状态，从而引起外周血淋巴细胞阻滞于次级淋巴器官，阻止淋巴细胞再循环以及直接抑制星形胶质细胞的反应，该药已成功用于多发性硬化症的治疗[8]。作为免疫抑制剂发展起来的S1P1选择性拮抗剂对其他自身免疫性疾病也有很好的疗效，如处于临床试验阶段的KRP-203治疗亚急性红斑狼疮，ACT-128800治疗银屑病，SAR-100842(Sanofi)治疗系统性硬化症及相关纤维化疾病[9]等。同时，S1P也被证明可以诱导COX2的表达，进而促进PEG2的生成，而COX2和PEG2被认为在原发性SS的发生和发展中发挥着重要的作用。因此，针对S1P1的基因治疗是治疗原发性干躁综合征的策略之一，S1P1成为越来越多疾病的治疗靶点。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)作为一种基因治疗手段已经用于临床疾病的治疗，如癌症[10]、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)[11]和自身免疫性疾病[12]等。RNAi的作用机制是通过靶细胞中导入双链RNA(double strands RNA, dsRNA)有效降解与其互补的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，导致转录后水平的基因沉默，调控基因的表达[13]。慢病毒载体递送效率高且由其携带导入的目的基因可以有效地整合到宿主染色体上长期、稳定地表达，而且慢病毒免疫原性低，能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞，为基因功能研究提供了更强有力的工具。Lian等[14]为研究PTP4A3的siRNA对人肺癌细胞H1299生长的影响，构建了PTP4A3 siRNA慢病毒表达载体感染人肺癌H1299细胞，细胞中PTP4A3 mRNA和蛋白水平均下降，细胞生长和集落形成也被抑制。Lu等[15]研究了三化汤对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠神经的保护作用，并通过构建水通道蛋白(AQP4)siRNA慢病毒载体注射于成年雄性SD大鼠，探讨此过程中的作用靶点是AQP4，结果大鼠脑组织含水量、AQP4的表达下降，注射AQP4 siRNA后，治疗效果更明显。本研究遵循siRNA的设计原则，设计了两段siRNA序列并构建慢病毒表达载体pLL3.7-S1P1-siRNA，根据siRNA的作用机制，借助慢病毒载体将特异性靶向S1P1 siRNA递送到HSG细胞，探讨S1P1的siRNA治疗干燥综合征的可能性。同时本研究还发现，S1P1-siRNA组HSG细胞中的S1P1 mRNA的表达与空白组、空载体组和scramble-siRNA组比较明显下降，充分说明S1P1的特异性siRNA能在基因水平上沉默其表达。本研究进一步采用免疫组织化学法检测HSG细胞中S1P1的蛋白表达情况，结果显示S1P1-siRNA组S1P1的蛋白表达水平与空白组、空载体组和scramble-siRNA比较明显减弱，差异有统计学意义，说明S1P1 siRNA能抑制S1P1在蛋白水平的表达，提示本研究S1P1 siRNA序列具有更好的基因沉默效果。

辅助性T细胞(helper T cell，Th)是根据功能分类的一个T细胞亚群，依据其分泌细胞因子的不同，CD4+T可分为Th1、Th2、Th17等亚型，Th1分泌IFN-γ等，主要介导细胞毒性T细胞和局部炎症有关的免疫应答，辅助抗体生成，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的发生。Awada等[16]在研究IL-33-ST2轴对原发性SS的作用时，发现患者高表达IFN-γ。Wu等[17]在研究养阴益气活血方对SS小鼠颌下腺和血清中Th1/Th2免疫平衡的影响中发现，与正常组相比，SS组IFN-γ水平升高，养阴益气活血方和羟氯喹治疗后IFN-γ血清浓度和蛋白表达均下降。Bian等[1]研究发现，CD25-/-SS小鼠高表达IL-17、IFN-γ，IFN-γ对CD25-/-SS泪腺破坏和分泌功能障碍起着关键作用。一些动物模型研究显示，IFN-γ不仅在SS免疫后期起着关键作用，在早期免疫前阶段也有影响。本研究结果发现，与空白组比较，S1P1的siRNA作用于HSG细胞后，IFN-γ的浓度明显下降，提示S1P1的siRNA可以降低Th1相关细胞因子的表达，从而减轻SS的炎症反应。

Th17是一种新发现的T细胞亚群，主要分泌IL-17等促炎因子，IL-17能诱导细胞因子和趋化因子促进淋巴细胞募集、活化、迁移到靶组织，如类风湿性关节炎的滑膜组织[18]或系统性红斑狼疮患者的肾组织[19]，在自身免疫性疾病中具有重要意义。有很多研究也表明IL-17在多种自身免疫性疾病的发病机制中起到关键作用，包括原发性SS[20]。Nguyen等[21]首次探讨了IL-17、IL-23在SS小鼠和患者唾液腺组织中的表达情况，结果显示IL-17表达上调。Wang等[22]在研究环孢素(Cys) A抑制原发性SS患者Th17细胞激活的实验中发现，原发性SS组的IL-17 mRNA和蛋白的表达水平明显升高，Cys A处理后，其表达明显被抑制。Lu等[23]的研究发现，与正常组相比，SS组IL-17的mRNA转录水平和蛋白表达水平均升高，而治疗后其水平均下降，Th17/IL-17免疫炎症途径可能与SS外分泌腺免疫炎性损伤的分子机制相关。本研究结果表明，S1P1的siRNA作用于HSG细胞后，IL-17的浓度明显下降，提示S1P1的siRNA可以降低Th17细胞因子的表达，减轻SS的炎症反应，为SS的治疗提供实验基础和新思路。

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(2015-10-12收稿)

(本文编辑：任英慧)

Effect of type 1 sphingosine-1-phosphate receptor siRNA on human salivary gland cells

LI Qiong1, CHANG Zhi-fang1, YANG Guo-an2, PANG Chun-yan1,2, WANG Yong-fu1,2△

(1. Department of Rheumatology, the Fist Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China； 2. Key Autoimmunity Lab of Inner Mongolia Autonomous Region, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China)

Objective：To construct sphingosine 1-phosphate receptor-1 (S1P1)-small interfering RNA (siRNA) lentiviral vectors and infect human salivary gland cells (HSG), and to investigate its possible therapy on Sjögren’s syndrome. Methods: HSG cells were divided into blank group, empty vector group, scramble-siRNA group and S1P1-siRNA group. The lentiviral vectors expressing siRNA againstS1P1 and the pLL3.7 were respectively transfected into 293T cells with pMD2.G, pMDL g/p RRE, pRSV-REV to produce virus, and then infect HSG cells. The efficiency was observed by flow cytometry after the transfection for 48 h. The expression levels ofS1P1 mRNA of HSG were detected by real-time RT-PCR and the expression of S1P1 protein was detected by immunohistochemistry method. The expression levels of interferon-γ (IFN-γ) and interleukin (IL)-17 in the supernatant of the cells were detected by ELISA method. Results:(1) The scramble-siRNA, S1P1-siRNA lentiviral vector was successfully constructed, and the lentivirus titer was about 3.5×108TU/mL. (2) The level ofS1P1 mRNA was lower in S1P1-siRNA group than those in the blank group, empty vector group, and scramble-siRNA group 48 h after infection, there were significant differences between them (P<0.05). (3) The expression of S1P1 protein was lower in S1P1-siRNA group than those in blank group, empty vector group, and scramble-siRNA group 48 h after transfection, there were significant differences between them (P<0.05). (4) The levels of IL-17 were lower in S1P1-siRNA group than those in blank group, empty vector group, and scramble-siRNA group 48 h after transfection, there were significant differences between them (P<0.05). (5) The levels of IFN-γ in S1P1-siRNA group were lower than those in blank group, empty vector group, and scramble-siRNA group 48 h after transfection, there were significant differences between them (P<0.05). Conclusion: The lentiviral vector targeting S1P1 was successfully constructed.S1P1 siRNA could suppress the levels ofS1P1 mRNA and protein, and decrease the expression of IL-17 and IFN-γ.S1P1 siRNA could infect HSG cells stably and inhibit the expression ofS1P1 gene specifically and efficiently, and reduce the levels of inflammatory cytokines.

Receptors, lysosphingolipid; RNA, small interfering; Salivary glands; Acinar cells; Genetic vectors

内蒙古自治区科技计划项目(20120403)和国家自然科学基金(81360463)资助 Supported by the Inner Mongolia Autonomous Region Science and Technology Plan Projects (20120403) and the National Natural Science Foundation of China (81360463)

时间：2016-3-7 13：08：09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160307.1308.012.html

R593.2

A

1671-167X(2016)06-0987-07

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.012

△ Corresponding author’s e-mail, wyf5168@hotmail.com