血清鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1蛋白的检测与类风湿关节炎

金银姬，赵金霞，孙 琳，杨 麟，邢 瑞，刘湘源

(北京大学第三医院风湿免疫科， 北京 100191)



·论著·

血清鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1蛋白的检测与类风湿关节炎

金银姬，赵金霞，孙 琳，杨 麟，邢 瑞，刘湘源△

(北京大学第三医院风湿免疫科， 北京 100191)

目的：检测类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者血清中鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1, BRAF)蛋白水平，探讨该蛋白在RA诊断中的意义。方法： 纳入RA患者78例、其他风湿病患者96例、健康对照30例，应用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测所有患者血清中BRAF蛋白水平，分析BRAF蛋白与RA患者临床与实验室指标的关系。 结果： RA患者血清中BRAF蛋白水平明显高于其他风湿病组(P<0.01)及健康对照组(P<0.01),BRAF蛋白与类风湿因子(rheumatoid factor，RF)及免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)水平呈正相关(P<0.01)，与其他临床、实验室指标及细胞因子无相关性。将RA患者分为BRAF蛋白升高组及正常组，比较两组之间的差异，结果显示两组在临床及实验室指标分布上差异均无统计学意义。结论： RA患者血清中BRAF蛋白水平显著高于其他疾病组及健康对照组，提示BRAF蛋白可能参与RA的发病过程。

关节炎，类风湿；危险因素；鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1；BRAF蛋白

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病,目前RA发病机制尚不明确，抗原抗体反应在RA疾病发生及发展过程中起重要作用,近年来有研究发现，RA患者血清中可以检测到抗鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1, BRAF)蛋白抗体，提示其可能作为自身抗原参与RA发病,本课题组的前期研究发现BRAF蛋白在RA患者滑液及滑膜组织中表达增高，可能在RA病理过程中发挥作用[1]，但RA患者血清中BRAF蛋白表达情况及其在疾病中的意义尚不清楚，因此，本研究通过酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)法，检测了RA患者血清中BRAF蛋白水平，并评价其与其他临床和实验室指标之间的关系，为进一步了解BRAF蛋白在RA发病中的作用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究为回顾性研究，血清标本来自2008年1月至2013年12月北京大学第三医院风湿免疫科住院及门诊患者，入选患者均符合各疾病的国际诊断或分类标准。RA患者组共78例，男性21例，女性57例，平均年龄(52±15)岁，平均病程96个月(1～480个月)；其他风湿病患者组96例，其中骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者32例、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者16例，痛风患者16例，强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者16例，干燥综合征(Sjögren syndrome，SS)16例；健康对照组30例，来自北京大学第三医院健康查体者。本研究开始前经北京大学第三医院伦理委员会审查批准(IRB00006761-2012011)。

1.2 血清标本的采集

所有备选对象均空腹抽取静脉血4 mL，室温下放置30 min使其凝固，3 000r/min离心10 min，分离血浆约1.5 mL至-80 ℃冰箱保存。

1.3 血清中BRAF蛋白的检测

采用BRAF ELISA试剂盒(购自武汉华美生物工程有限公司)检测血清中的BRAF蛋白浓度，所有标本均行复孔检测，具体操作按说明书进行,依据标准曲线检测标本中BRAF蛋白(质量)浓度(ng/L)。

1.4 血清中细胞因子的检测

采用人TNF-α、人IL-1β、人IL-6、人IL-17A 的ELISA试剂盒(购自达科为生物技术有限公司)检测血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A浓度，所有标本均行复孔检测，具体操作按说明书进行,依据标准曲线检测标本中细胞因子浓度。

1.5 临床资料收集

回顾病历，获取RA患者的年龄、性别、病程、肿胀关节数、压痛关节数、患者对病情的总体评价视觉评分(visual assessment scale，VAS，范围0～10)、关节晨僵时间、关节畸形数以及关节外表现，同时收集红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、类风湿因子(rheumotoid factor，RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti cyclic citrullinated peptide antibody；anti-CCP antibo-dy)、抗角蛋白抗体(antikeratin antibody)、免疫球蛋白7项、抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)等实验室指标。

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，组间率的比较采用卡方检验。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间均值的比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，非正态分布的计量资料以中位数(范围)表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两变量之间相关性分析采用Spearman相关分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BRAF蛋白在RA和其他风湿病中的表达水平

RA患者血清中BRAF蛋白的浓度显著高于OA、SLE、AS、痛风、SS及健康对照组(P均<0.01)，OA组BRAF蛋白浓度高于健康对照组(P=0.007，表1)。

2.2 BRAF蛋白与RA临床及实验室指标的相关性分析

在RA患者中，将BRAF蛋白水平与年龄、病程及实验室检查进行相关分析，发现BRAF蛋白与免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA，r=0.447，P=0.006)及RF(r=0.357，P=0.009)水平呈正相关，与年龄、病程、DAS28水平、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A及其他实验室指标无相关性。

表1 BRAF蛋白在不同疾病组的浓度

RA, rheumatoid arthritis; OA, osteoarthritis; SLE, systemic lupus erythematosus; AS, ankylosing spondylitis; SS, Sjögren syndrome.

2.3 BRAF蛋白升高组和正常组中RA患者实验室指标比较

健康对照组BRAF蛋白95%置信区间为1 152～1 963 ng/L，以1 963 ng/L为cut off值，根据RA患者血清BRAF蛋白水平分为升高组及正常组，其中BRAF蛋白水平升高组46例，BRAF蛋白水平正常组7例。比较两组各临床及实验室指标的差异，结果显示两组在年龄、病程、DAS28、ESR、CRP等指标分布上差异无统计学意义(表2)。

表2 BRAF蛋白正常组和升高组实验室指标的比较

CRP, C reactive protein; ESR, erythrocyte sedimentation rate; RF, rheumatoid factor; CCP, cyclic citrullinated peptide; TNF-α, tumor necrosis factor-α; IL-6, interleukin-6.

3 讨论

BRAF基因定位于人染色体7q34，含18个外显子，其编码的B型有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖性激酶(ras associated factor, RAF)相对分子质量为94 000，由783个氨基酸组成，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路的关键成分。该酶将信号从Ras 转导至MEK1/2, 从而参与调控细胞的生长、增殖和凋亡[2-4]。MAPK信号通路在RA发病机制中发挥作用，参与调控细胞因子和组织金属蛋白酶的产生[5-6]，同时参与B细胞抗原受体、T细胞受体、Toll样受体，以及IL-1、IL-17和TNF受体介导的信号通路，MAPK信号通路在TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子产生过程中也发挥重要作用[7]。2009年,Auger等[8]首次发现RA患者的血清中存在可特异性识别BRAF抗原的抗体，阳性率达47.4%，明显高于其他风湿病与健康对照组。Charpin等[9]进一步采用ELISA方法研究了RA患者血清中针对BRAF蛋白及其各个肽段的抗体水平，发现在35%的RA患者血清中可以检测到抗BRAF抗体，而强直性脊柱炎和健康对照组的检出率仅为4%和6%。这些研究提示抗BRAF抗体可能参与RA的发病过程。

本研究检测了RA患者BRAF蛋白水平，显示BRAF蛋白在RA患者血清中的水平显著高于其他疾病组及健康对照组，另外，在RA患者中BRAF蛋白水平与类风湿因子及IgA呈正相关，但与DAS28、ESR、CRP、TNF-α、IL-6无相关性，提示BRAF蛋白可能与类风湿因子及免疫球蛋白的产生有关，可能参与B细胞活化以及抗体产生过程，而与RA疾病活动度无明显相关性。目前已有报道[1]，RA患者滑液和滑膜组织中BRAF蛋白水平高于骨关节炎及正常对照组，以上结果提示BRAF可能参与RA的发病过程。BRAF作为RAF成员之一，其编码的产物可激活MAPK通路，而MAPK通路在RA发病过程起到重要作用，提示BRAF可能通过激活MAPK通路参与促炎因子产生，从而参与RA发病。此外，RA患者BRAF蛋白水平增高，既往研究提示RA患者中抗BRAF抗体亦升高[9-11]，提示BRAF蛋白本身可能作为自身抗原产生抗BRAF抗体，通过抗原抗体反应参与RA发病。

有研究提示，RA患者中存在BRAF基因突变[12]，且大部分抗环瓜氨酸多肽抗体阳性的RA患者存在BRAF基因V600A突变[13]，但目前BRAF及其产物参与RA发病过程的确切机制尚不清楚，进一步研究其基因及相关产物在RA中的表达可能对揭示RA发病机制有帮助，从而对其进行干预，起到治疗的作用。

综上所述，BRAF蛋白在RA患者中显著升高，提示BRAF蛋白可能是RA患者自身抗原之一，参与RA的发病过程。

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(2016-08-04收稿)

(本文编辑：王 蕾)

Significance of v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1 in rheumatoid arthritis

JIN Yin-ji， ZHAO Jin-xia， SUN Lin， YANG Lin， XING Rui， LIU Xiang-yuan△

(Department of Rheumatology and Immunology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China)

Objective： To detect serum v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1 (BRAF) protein levels and to investigate their clinical significance in rheumatoid arthritis (RA) patients. Me-thods: Serum samples were obtained from 78 RA patients, 32 osteoarthritis (OA) patients, 16 systemic lupus erythematosus (SLE) patients, 16 gout patients, 16 ankylosing spondylitis (AS) patients, 16 Sjögren syndrome (SS) patients and 30 healthy controls. BRAF protein in the sera was examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The associations between BRAF levels and the clinical features including age, sex, disease duration, swelling joints, tenderness joints, duration of moning stiffness, joint deformity, visual assessment scale (VAS) and extra articular manifestations and laboratory parameters including erythrocyte sedimentation rate (ESR), C reactive protein (CRP), rheumatoid factor (RF), disease activity score in 28 joints (DAS28), anti cyclic citrullinated peptide (CCP) antibo-dy, antikeratin antibody, antnuclear antibody (ANA), immunoglobulin and cytokines, such as TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-17A in RA patients were evaluated. Data analyses were performed by using SPSS 19.0 program. Results: The serum BRAF protein levels in the RA patients were significantly higher than those of other rheumatic diseases groups including OA, SLE, AS, SS, gout patients and healthy controls, thePvalue was 0.002, <0.001, <0.001, <0.001, 0.001 and <0.001 respectively. The level of serum BRAF protein in the RA patients showed a positive correlation with the rheumatoid factor (P=0.009) and IgA levels (P=0.006), but no correlation with clinical features, such as age and duration or other laboratory parameters, including CRP, ESR, anti-CCP antibody, IgM, IgG, TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-17A. The RA patients were further divided into normal levels of BRAF protein group and elevated levels of BRAF protein group. Compared with the clinical features and laboratory indexes of normal and elevated levels of BRAF protein groups in the RA patients, there was no significant difference between the two groups in age, duration, DAS28, CRP, ESR, RF, anti-CCP, IgA, IgG, IgM, TNF-α or IL-6. Conclusion: The elevated level of BRAF protein in the RA patients showed that BRAF might play a role in the pathogenesis of RA. Further researches on BRAF gene expression may help to clarify the role of BRAF in RA.

Arthritis, rheumatoid; Risk-factors; v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1, BRAF protein

国家自然科学基金(81273293)和北京大学第三医院院种子基金(Y87473-01)资助 Supported by the Natural Science Foundation of China (81273293) and Seed Foundation of Peking University Third Hospital (Y87473-01)

时间：2016-11-25 16：35：51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161125.1635.020.html

R593

A

1671-167X(2016)06-0947-04

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.005

△Corresponding author’s e-mail, Liu-xiangyuan@263.net