抗瓜氨酸化葡萄糖-6-磷酸异构酶多肽抗体的检测及其在类风湿关节炎中的意义

武 东，孙 琳，李常虹，杨 麟，赵金霞，刘湘源

(北京大学第三医院风湿免疫科， 北京 100191)



·论著·

抗瓜氨酸化葡萄糖-6-磷酸异构酶多肽抗体的检测及其在类风湿关节炎中的意义

武 东，孙 琳，李常虹，杨 麟，赵金霞△，刘湘源△

(北京大学第三医院风湿免疫科， 北京 100191)

目的：检测类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者血清中抗瓜氨酸化葡萄糖-6-磷酸异构酶(citrullinated glucose-6-phosphate isomerase，C-GPI)70～88肽抗体(抗C-GPI70～88抗体)和抗C-GPI 435～453肽抗体(抗C-GPI435～453抗体)的水平，同时检测其原型多肽抗体水平，评价抗C-GPI多肽抗体在RA诊断中的价值。方法： 应用酶联免疫吸附法检测191例RA患者、129例其他风湿免疫疾病患者和74例健康对照组血清中抗C-GPI70～88抗体、抗C-GPI435～453抗体、抗GPI70～88抗体和抗GPI435～453抗体的水平，并收集RA患者临床和实验室检查数据，分析抗C-GPI多肽抗体在RA诊断中的价值以及与临床和实验室指标的相关性。结果： (1)RA组抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体的滴度(68.71±4.20和51.78±3.13)显著高于疾病对照组和健康对照组(P<0.05)，而抗GPI70～88抗体和抗GPI435～453抗体的滴度在各组中差异无统计学意义。(2)抗C-GPI70～88抗体在RA诊断中的敏感性为41.88%，特异性为84.50%；抗C-GPI435～453抗体在RA诊断中的敏感性为46.05%，特异性为86.05%;联合检测两种抗瓜氨酸化多肽抗体的敏感性为50.79%，特异性为86.05%。(3)抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体在类风湿因子、抗角蛋白抗体、抗环瓜氨酸肽抗体均阴性的RA患者中的阳性率分别为35.00%和45.00%。(4)RA患者抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体阳性组和阴性组之间临床和实验室指标差异无统计学意义。结论： RA患者体内可以检测到抗C-GPI多肽抗体，C-GPI可能参与了RA的发病，对于血清阴性的RA患者有较好的诊断价值。

关节炎，类风湿；瓜氨酸化；葡萄糖-6-磷酸异构酶

瓜氨酸化抗原在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的异常免疫反应中起重要作用[1]，抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)是RA的特异性抗体，在RA的诊断中具有重要意义。近年来研究发现，多种瓜氨酸化抗原参与RA的发病，如瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原、瓜氨酸化Ⅱ型胶原等。以往的研究已证实葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isome-rase，GPI)是RA的自身抗原，但关于其瓜氨酸化蛋白的研究很少。2013年Umeda等[2]首次研究发现RA患者血清中可以检测到抗瓜氨酸化GPI(ci-trullinated GPI，C-GPI)多肽抗体，其中70～88肽和435～453肽的瓜氨酸化形式抗体对RA的诊断具有较高的敏感性和特异性，可能是RA诊断的标记性抗体并与疾病活动性相关。

为进一步评价抗C-GPI多肽抗体在RA中的意义，本研究合成GPI70～88和GPI435～453两条多肽的原型，并以瓜氨酸替代序列中的两个精氨酸合成多肽的瓜氨酸化形式C-GPI70～88和C-GPI435～453，在多肽两端加半胱氨酸进行环化得到4条多肽。以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法检测RA组和对照组血清中上述4条多肽的抗体水平，并评价其在RA中的意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

共收集血清标本394份，包括：(1)RA组191例，均为2014年9月至2015年9月北京大学第三医院风湿免疫科住院或门诊患者，所有患者符合2010年美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)修订的RA分类标准，其中男性65例、女性126例，平均年龄(57.08±1.42)岁；(2)其他风湿免疫疾病组(疾病对照组)129例，其中男性48例、女性81例，平均年龄(47.50±1.65)岁，包括系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)36例、骨关节炎(osteoarthritis，OA)41例、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)17例、痛风(gout)8例和其他结缔组织病(系统性血管炎、干燥综合征、未分化结缔组织病)27例，均符合相应疾病的国际分类标准；(3)正常对照组74例，为体检健康人员，其中男性30例、女性44例，平均年龄(49.20±1.37)岁。上述3组对象年龄、性别差异均无统计学意义，各组血清均来源于临床检验的剩余标本。本研究经北京大学第三医院医学科学研究伦理委员会批准，所有受试者均知情同意。

1.2 合成多肽

GPI多肽原型序列：(1)GPI70～88：CDLAKSRG-VEAARERMFNGEC(70～88)；(2)GPI435～453：CALMRGKSTEEARKELQAAGC(435～453)；C-GPI多肽序列：(1)C-GPI70～88：CDLAKSXGVEAAXERMFNGEC(X代表瓜氨酸)；(2)C-GPI435～453：CALMX-GKSTEEAXKELQAAGC。4条多肽两端加半胱氨酸进行环化。以上多肽委托北京中科亚光生物科技有限公司合成，纯度95%。

1.3 血清中多肽抗体的检测

以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)稀释多肽，终浓度10 mg/L，包被96孔板，100 μL/孔，4 ℃过夜；加入50 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)-PBS，300 μL/孔，4 ℃封闭过夜；用3%BSA-PBS按1 ∶200稀释患者及对照组血清，100 μL/孔，室温2 h；0.05%(体积分数)磷酸盐吐温缓冲液洗板5次，300 μL/孔；加入山羊抗人免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)(辣根过氧化物酶标记)， 浓度1 ∶1 000，100 μL/孔，室温1 h；0.05%磷酸盐吐温缓冲液洗板5次，300 μL/孔；采用3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(3, 3′, 5, 5′-tetramethyl benzidine，TMB)底物显色试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)避光显色20 min，加入终止液，置于酶标仪中，450 nm波长下读取光密度值，即吸光度值(absorbance, A)。所有样品均做复孔，每板均设阳性对照和阴性对照。吸光度单位(absorbance unit，AU)值=(A待测血清-A非特异背景)/(A标准血清-A非特异背景)×100，标准血清为阳性标准血清。

1.4 其他实验室指标

收集患者的临床资料及实验室指标，临床指标包括：性别、年龄、病程长短、有无间质性肺炎患者胸部X线检查结果提示肺间质纤维化定为阳性)、疾病活动度评分(disease activity score 28-erythrocyte sedimentation rate，DAS28-ESR)；实验室指标包括: 抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体和抗角蛋白抗体(anti-keratin antibody，AKA)、类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)等。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 抗C-GPI70～88抗体和抗GPI70～88抗体在RA及对照组中的水平

抗C-GPI70～88抗体在各组患者中的滴度分别为：RA组68.71±4.20、健康对照组46.12±3.50、OA组44.45±3.49、SLE组40.09±3.89、AS组35.23±3.09、痛风组31.74±5.07、其他结缔组织病组36.26±2.63，各组之间差异有统计学意义(单因素方差分析，F=6.219，P<0.001)，RA患者IgG型抗C-GPI70～88抗体滴度显著高于健康对照组(46.12±3.50)和疾病对照组(39.93±1.75)，差异有统计学意义(P<0.05，图1)，而RA患者IgG型抗GPI70～88抗体滴度均值(42.74±2.60)与健康对照组(48.44±3.60)和疾病对照组(36.66±2.10)差异无统计学意义(P>0.05，图2)。

Abbreviations as in Figure 1.

图2 RA组、健康对照组及疾病对照组抗GPI抗体滴度(AU值)的比较

Figure2 Comparison of the titers (AU value) of anti-GPIantibody in RA patients, healthy controls and disease controls

2.2 抗C-GPI435～453抗体和抗GPI435～453抗体在RA及对照组中的水平

抗C-GPI435～453抗体在各组患者中的滴度分别为：RA组51.78±3.13、健康对照组33.27±2.72、OA组27.93±2.01、SLE组30.90±5.54、AS组22.65±3.10、痛风组23.87±4.16、其他结缔组织病组24.32±1.72，各组间差异有统计学意义(单因素方差分析，F=7.592，P<0.001)。RA患者IgG型抗C-GPI435～453抗体滴度显著高于健康对照组(33.27±2.72)和疾病对照组(27.06±1.80)，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。而RA患者IgG型抗GPI435～453抗体滴度均值(55.50±3.77)与健康对照组(45.69±3.10)和疾病对照组(40.80±2.10)差异无统计学意义(P>0.05，图4)。

Abbreviations as in Figure 1. *P<0.05, vs. normal group or all of the disease control groups.

图3 RA组、健康对照组及疾病对照组抗C-GPI抗体滴度(AU值)的比较

Figure3 Comparison of the titers (AU value)of anti-C-GPIantibody in RA patients, healthy controls and disease controls

2.3 抗C-GPI70～88抗体在RA诊断中的敏感性和特异性

抗C-GPI70～88抗体的ROC曲线下面积为 0.621，95%CI为0.564～0.677，临界值为58.64，诊断敏感性为41.88%，特异性为84.50%，阳性预测值为80.00%，阴性预测值为49.55%，而抗GPI70～88抗体的ROC曲线下面积为0.465，无诊断意义。

Abbreviations as in Figure 1.

图4 RA组、健康对照组及疾病对照组抗GPI抗体滴度(AU值)的比较

Figure4 Comparison of the titers (AU value)of anti-GPI antibody in RA patients, healthy controls and disease controls

2.4 抗C-GPI435～453抗体在RA诊断中的敏感性和特异性

抗C-GPI435～453抗体的ROC曲线下面积为0.654，95%CI为0.599～0.709，临界值为41.78，诊断敏感性为46.05%，诊断特异性为86.05%，阳性预测值为83.02%，阴性预测值为51.87%，而抗GPI435～453抗体的ROC曲线下面积为0.569。

2.5 抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体并联检测的诊断意义

两者并联检测在RA中的阳性率为50.79%，特异性为81.40%，阳性预测值为80.17%，阴性预测值为50.79%，抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体联合检测的敏感性有所提高，特异性略下降。

2.6 抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体对血清阴性RA的诊断价值

抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体在RF阴性RA患者(48例)中的阳性率分别为33.33%和37.50%，抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体在RF、AKA、CCP均阴性的RA患者(20例)中的阳性率分别为35.00%和45.00%。

2.7 抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体阳性组和阴性组的临床及实验室指标比较

抗C-GPI70～88抗体阳性RA患者80例、阴性111例，抗C-GPI435～453抗体阳性RA患者88例、阴性103例，将两个抗体的阳性组与阴性组分别进行比较发现，阳性组较阴性组更加年轻(P<0.01)，但病程长短、DAS28-ESR评分、ESR、CRP、有无合并间质性肺炎、RF、AKA、CCP等指标在阳性组和阴性组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

GPI是一种多功能蛋白，在糖酵解和糖异生中发挥重要作用，并能促进细胞增殖和迁移，具有神经营养和细胞因子的特性[3]。2001年Schaller等[4]的研究发现，64%的RA患者血清及关节液中IgG型抗GPI抗体和GPI抗原滴度升高，Cha等[5]的研究也发现RA患者关节液中存在大量的GPI抗体，表明GPI抗原及其抗体可能参与了RA的发病。然而关于GPI的研究结果并不一致，有研究显示GPI及其抗体会加重RA关节炎症[6]，也有报道认为GPI与病情活动度及骨侵蚀无明显相关，且其阳性率不高[7]。目前关于C-GPI在RA中的作用研究较少，Umeda等[2]检测了RA血清中7条抗C-GPI多肽抗体水平，发现其中的抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体在RA患者中阳性率和特异性均优于抗GPI抗体，且与疾病活动度相关，提示C-GPI可能也参与了RA的发病。本研究在我国RA人群中检测了血清中抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体及其原型肽抗体的水平，进而探讨瓜氨酸化GPI在RA中的意义，结果发现抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体的滴度在RA组显著高于其他各组，而未经瓜氨酸修饰的原型肽抗体滴度在各组中差异无统计学意义，再次证实RA患者血清中可以检测到抗C-GPI多肽抗体，提示C-GPI可能作为RA的自身抗原参与其发病过程。

关于GPI及其抗体在RA中的诊断价值，以往大多数研究结果表明GPI 抗原诊断RA的敏感性>65%，特异性≥90%，有较高的诊断价值[8-9]，而抗GPI抗体在RA诊断中的价值研究结果差异较大，诊断敏感性为4.5%～75.0%，特异性为64.3%～95.9%[10-15]。Umeda等[2]的研究发现，抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体在RA患者中的阳性率分别为25.5%和37%，对RA诊断的特异性高达98.1%～99.7%，可能是RA的诊断抗体。本研究评估了本组RA患者抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体的诊断价值，发现其敏感性分别为41.88%和46.05%，优于Umeda等[2]的结果，但特异性却下降，分别为84.50%和86.05%，造成这一差异的原因可能为：首先，纳入的患者人种不同；其次，Umeda等[2]的研究中C-GPI70～88的3个精氨酸均被替换为瓜氨酸，而在本研究中C-GPI70～88的3个精氨酸只有前2个被替换为瓜氨酸，这一差别可能影响了抗体的敏感性和特异性；再次，我们测定的是瓜氨酸化多肽的抗体，而非蛋白，可能不能反映瓜氨酸化蛋白的所有表位，对敏感性和特异性也有一定影响。总之，鉴于本研究结果显示其特异性不到90%，其是否可以作为RA诊断的特异性指标尚有待更多的研究验证。

Umeda等[2]的研究还发现该抗体与疾病活动度相关，经肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)拮抗剂治疗后，RA患者体内抗C-GPI多肽抗体滴度下降，但在本组RA患者中，抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体阳性组与阴性组临床资料比较发现，DAS28-ESR评分、ESR、CRP、病程长短、间质性肺炎等指标两组间差异无统计学意义，未能发现该抗体与疾病活动度的联系。由于本研究未能比较抗体阳性RA患者治疗前后的抗体水平变化，因此对于其与疾病活动度及预后的相关性尚有待进一步研究。

临床上对于血清阴性RA患者的诊断缺少特异的实验室指标，因此探索这些患者新的特异性诊断指标具有很大的临床意义。本研究发现，抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体在血清阴性RA患者中的阳性率分别为35.00%和45.00%，可见其对血清阴性RA患者具有较高的诊断意义。

总之，本研究结果显示C-GPI的确是RA的一种抗原，对于阐述RA的发病机制有一定意义。其在血清阴性RA患者中有一定的阳性率，可以为RA的诊断提供帮助。当然，本研究结果显示其特异性低于90%，是否可作为特异性诊断指标尚需要更大样本量的研究来证实。

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(2016-03-18收稿)

(本文编辑：赵 波)

Significance of antibodies to the citrullinated glucose-6-phosphate isomerase peptides in rheumatoid arthritis

WU Dong, SUN Lin, LI Chang-hong, YANG Lin, ZHAO Jin-xia△, LIU Xiang-yuan△

(Department of Rheumatology & Immunology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China)

Objective： To detect the anti-citrullinated glucose-6-phosphate isomerase (GPI) 70-88 peptide antibody(anti-C-GPI70-88antibody),anti-citrullinated GPI 435-453 peptide antibody(anti-C-GPI435-453antibody), anti-GPI 70-88 peptide antibody(anti-GPI70-88antibody) and anti-GPI 435-453 peptide antibody(anti-GPI435-453antibody) in the serum of rheumatoid arthritis(RA) patients,and exa-mine the diagnostic values of the anti-C-GPI peptide antibodies in RA. Methods: The anti-C-GPI70-88antibody, anti-C-GPI435-453antibody, anti-GPI70-88antibody and anti-GPI435-453antibody were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) in 191 RA patients,129 other rheumatic diseases and 74 healthy controls. The clinical and laboratory data of the patients with RA were collected, and the values of anti-C-GPI peptide antibodies in the diagnosis of RA and the relationships of anti-C-GPI peptide antibodies with the clinical and laboratory parameters analyzed. Results: (1)The mean titers of the anti-C-GPI70-88antibody and the anti-C-GPI435-453antibody in the RA patients (respectively, 68.71±4.20 and 51.78±3.13) were significantly higher than those with other rheumatic diseases and healthy individuals(P<0.05). However,the mean titers of the anti-GPI70-88antibody and anti-GPI435-453antibody in the RA patients were similar to those with other rheumatic diseases and healthy individuals.(2)The diagnostic sensitivity and specificity of the anti-C-GPI70-88antibody for RA were 41.88% and 84.50% respectively; and the diagnostic sensitivity and specificity of the anti-C-GPI435-453antibody for RA were 46.05% and 86.05% respectively.The sensitivity of combined detection of the two anti-C-GPI peptide antibodies was 50.79%, and the specificity was 81.40%. (3) The positive rates of the anti-C-GPI70-88antibody and the anti-C-GPI435-453antibody were 35% and 45% respectively in those patients with negative anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-keratin antibody, and rheumatoid factor. (4) There was no significant difference in clinical and laboratory indicators between the anti-C-GPI70-88antibody or anti-C-GPI435-453antibody positive group and negative group. Conclusion: The anti-C-GPI70-88antibody and anti-C-GPI435-453antibody can be detected in the serum of RA patients, and C-GPI may be involved in the pathogenesis of RA. There is a certain diagnostic significance for the sera-negative RA.

Arthritis, rheumatoid; Citrulline; Glucose-6-phosphate isomerase

国家自然科学基金(81571573)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81571573)

时间：2016-11-2 9：03：46

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161102.0903.020.html

R593.22

A

1671-167X(2016)06-0937-05

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.003

△Corresponding author’s e-mail, zhao-jinxia@163.com, liu-xiangyuan@263.net