东亚飞蝗肠道内高产纤维素酶菌株筛选及鉴定

徐 冲， 钟丽娟， 陈丽媛， 陈 杰， 孙翠焕， 朱巍巍， 关艳丽

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

东亚飞蝗肠道内高产纤维素酶菌株筛选及鉴定

徐 冲， 钟丽娟*， 陈丽媛， 陈 杰， 孙翠焕， 朱巍巍， 关艳丽

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

为微生物制剂生产筛选菌种资源。运用昆虫解剖技术取出东亚飞蝗(Locustamigratoriamanilensis)肠道，采用稀释涂板法对肠道内的菌种进行分离，并利用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)改良培养基初筛产纤维素酶菌株。结果表明，从东亚飞蝗肠道内共分离得到12株产纤维素酶菌株，均为细菌，并对纤维素酶活较高的菌株K005进行了形态学和分子生物学鉴定，通过菌落及菌体形态特征、生理生化特性、16S rDNA序列测定结果，将该菌株鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。

东亚飞蝗；肠道；纤维素酶；蜡样芽胞杆菌

近些年，人们对环保、生态、资源循环利用等日益重视，纤维素的利用也在不同领域得到了扩展。随之而来的关于纤维素相关的科学研究也逐渐增多，主流为两个方向，即农业和畜牧业，通过微生物的作用将纤维素类资源降解后为作物或牲畜所用，因此高纤维素酶活菌种的筛选与应用成为十分必要的工作。已报道的文献[1-4]中，科研人员主要通过土壤、腐烂的秸秆、食草动物的瘤胃等样品进行菌种的分离，也有从白蚁和西伯利亚蝗虫肠道中分离纤维素酶菌株[5]，这些研究不仅丰富了菌种的来源，也为更有效利用纤维素提供了更多的可能。本研究对东亚飞蝗肠道内的产纤维素菌种进行了分离，并对其进行了形态、生理生化及分子生物学鉴定。旨在通过更多途径筛选可降解纤维素的菌株，进而满足科研与应用的需要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 分离样品为东亚飞蝗肠道，飞蝗样品采集自辽宁省朝阳市市郊大凌河流域的草地。

1.1.2 培养基 CMC-Na培养基：CMC-Na 5.0 g，MgSO40.5 g，KH2PO42.0 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，pH 7.0～8.0；NA培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3 试剂 ①刚果红10 mg/mL；②吕氏美蓝染色液：配制A液(亚甲基蓝0.3 g，95%酒精30 mL)、B液(称取氢氧化钾(KOH) 0.01 g，加入100 mL蒸馏水)，然后A液和B液混合即成吕氏美蓝染色液。

1.2 方法

1.2.1 菌种筛选[6]将蝗虫虫体浸于70%酒精中约7～8 min，至其死亡，于超净工作台上，将其移至灭菌平皿中，剪去足与翅，用剪刀从背部肛门处剪至胸部，用已事先灭菌的解剖针拨开虫体体表，用无菌镊子取出消化道，放于事先灭菌的研钵中研磨。然后加入10 mL无菌水制成菌悬液，依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。分别取0.1 mL稀释液于平板中，涂抹均匀，30 ℃培养。

1.2.2 菌种的分离纯化[7]定期检查平板菌落的生长情况，采用划线法进行菌种的分离与纯化，待纯化2～3次后备用。

1.2.3 产纤维素酶菌株初筛[8-9]将纯化好的菌株点接至CMC-Na的平板上培养48 h，记录菌落直径，将每块平板中倒入刚果红染液进行染色1 h后，将平板置于缓慢的流水下冲洗3～5 min，有纤维素酶活的菌种会出现透明圈，用游标卡尺测定透明圈的直径。透明圈越大表明其产纤维素酶的能力越强。

1.2.4 菌种鉴定 ①生理生化鉴定：菌落、菌体形态及生理生化特性参照《伯杰细菌鉴定手册》[10]和东秀珠编著的《常见细菌系统鉴定手册》[11]等方法进行鉴定。②PCR扩增16S rRNA基因测序与分析[12-14]：变性反应液使用TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.D304)试剂盒(反应条件：80 ℃，15 min)；PCR 扩增使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)试剂盒；使用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No. DV805A)切胶回收目的片段进行 DNA 测序；以 16S Forward、16S Internal 和 16S Reverse 为引物进行测序。将所得序列在GenBank数据库经BLAST比对后对菌株进行同源性分析，根据相似性最高的序列推测待鉴定细菌可能的分类地位。相关序列经分析软件CLUSTAL X 1.81比对后，通过MEGA3.1采用邻近法绘制相关菌株的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌种分离及产纤维素酶菌株初筛结果

对东亚飞蝗的肠道内微生物进行了多次分离，共分离得到30余菌株，其中有纤维素酶活的菌株有12株，均为细菌。通过比较其透明圈大小以及透明圈与菌落直径的比值，其中菌株K005的纤维素酶活最高，透明圈与菌落直径的比值可达5.39，见表1。

表1 产纤维素酶菌株初筛结果Table 1 Preliminary screening results of cellulase producing strains

2.2 K005菌株形态及生理生化鉴定结果

菌株K005在NA培养基上生长较好，37 ℃，48 h时形成直径3～5 mm的圆形菌落，菌落乳白色，表面有光泽，湿润，边缘整齐。镜检菌体为杆状，可见柱状芽胞，见图1。生理生化鉴定结果[12]见表2，参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》鉴定菌株K005隶属芽胞杆菌属Bacillussp.。

图1 K005菌落形态及芽胞形态Fig.1 Colony morphology and spore morphology of K005

项目K005项目K005革兰染色+甲基红+芽胞染色+V-P测定+H2S-淀粉水解+硝酸还原+吲哚产生-卵磷脂水解+明胶液化+接触酶+阿拉伯糖-厌氧生长+蔗糖+葡萄糖氧化发酵+木糖产酸-在7%氯化钠上生长+水解酪氨酸+

注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性

2.3 16S rDNA扩增及序列测定

1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果见图2，以16S Forward、16S Internal和16S Reverse为引物进行DNA测序，将测序结果向GenBank提交，序列登记号为KX507377。

2.4 菌株K005分子生物学鉴定

利用BasicBLAST将菌株K005的16S rDNA序列和NCBI中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，结果发现，该菌株与蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus的同源性高达100%，并利用MEGA3.1进行了系统发育树构建(图3)，结合生理生化鉴定、同源性比对及系统发育树等结果，鉴定该菌株属于芽胞杆菌属的蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。

图2 菌株K005 16S rDNA PCR扩增产物电泳图Fig.2 K005 16S rDNA amplification patterns M: DL2000 DNA Marker；1：CTD719-ZWW-PCR产 物；+：正对照；-：负对照 M: DL2000 DNA Marker；；1：CTD719-ZWW-PCR product；+：Positive control；-：Negative control

图3 根据16S rDNA基因序列构建系统发育进化树Fig.3 The Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

3 讨 论

目前产纤维素酶菌株的研究多集中在真菌方面，对细菌研究报道[15]相对略少。本研究所分离到的12株产纤维素酶菌株均为细菌。其中产纤维素酶活较高的K005经鉴定为蜡样芽胞杆菌，属于农业部批准的生物兽药可用微生物菌种，且该菌种分离自昆虫肠道，对氧气的需求较小，在进行工业化生产时具备一定的优势。

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Screening and Identification of High-Yielding Cellulase Strain from Enteric Duct in East Asian Locust (Locustamigratoriamanilensis)

XU Chong, ZHONG Li-juan, CHEN Li-yuan, CHEN Jie,SUN Cui-huan, ZHU Wei-wei, GUAN Yan-li

(LiaoningAcad.ofMicrobiol.,Chaoyang122000)

Screening of strain resources for the production of microbial agents. In this study the insect anatomy technology was used to draw out enteric duct in East Asia migratory locust (Locustamigratoriamanilensis), and isolated the bacterial strain with spreading dilution method, and using sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) modified medium to screen initially the cellulase producing strains. The results showed that a total of 12 intestinal strains were separated from the East Asia migratory locust that produce cellulase, all of them were bacteria, among them strain K005 with fairly high cellulase activity were studied on its morphology and molecular biology aspects of morphological for its identification. The results through colony morphologic features, cell morphologic features, physiological and biochemical specificities and 16S rDNA sequence analysis, the strain was identified asBacilluscereus.

East Asia locust (Locustamigratoriamanilensis); enteric duct; cellulase;Bacilluscereus

国家农业科技成果转化项目(国科发农[2010]297号)

徐冲 男，硕士研究生，助理研究员。主要从事应用微生物学研究。E-mail:sss646@163.com

* 通讯作者。女，硕士，副研究员。主要从事应用微生物学研究。Tel:0421-2976855，E-mail: benxiaohai_6666@163.com

2016-01-23；

2016-04-16

Q939.96

A

1005-7021(2016)03-0069-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.013