蚕豆根瘤菌接种效应研究

韩 梅， 张宏亮， 曹卫东

(1.青海省农林科学院 土壤肥料研究所，青海 西宁 810016；2.中国农业科学院 农业资源与农业区划研究所，北京 100081)

蚕豆根瘤菌接种效应研究

韩 梅1， 张宏亮1， 曹卫东2

(1.青海省农林科学院 土壤肥料研究所，青海 西宁 810016；2.中国农业科学院 农业资源与农业区划研究所，北京 100081)

为发掘和利用青海冷凉地区蚕豆优良的根瘤菌种质资源，确定根瘤菌的接种效应。将分离、纯化、分子鉴定的16株蚕豆根瘤菌通过盆栽回接试验的方法进行筛选。结果表明，筛选出6株根瘤菌，它们与青海13号蚕豆共生匹配效果较好，共生固氮能力强，促进蚕豆生长效果明显。

蚕豆根瘤菌；接种；固氮

蚕豆是青海省重要的农作物之一，也是青海省“十大”特色支柱产业。蚕豆生产具有推动区域经济发展、增加出口创汇和农民经济收益以及保护农田生态环境等经济、社会与生态三重效益。年种植面积2.67万hm2左右，产量基本稳定在7.0～9.0万t之间，商品率在70%以上。主产区分布在东部农业区的川水和低、中位山旱区，具有单产高、品质好、商品率高等特点[1]。但干旱半干旱区的蚕豆，由于土壤碱性重，盐分高，土著根瘤菌的数量相对较少，结瘤能力弱。为了提高干旱半干旱区的蚕豆结瘤能力，有针对性地选择高效、抗逆性强的菌株接种，提高固氮能力，增加产量。本研究是通过采集青海地区蚕豆根瘤菌，分离、纯化、PCR鉴定得到根瘤菌纯培养物，经过蚕豆盆栽回接试验，初步筛选出能在蚕豆根部结瘤的根瘤菌菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蚕豆品种 青海13号蚕豆。

1.1.2 菌株 分离鉴定的蚕豆根瘤菌，1～16号菌株采自蚕豆。采集时间为2013年7月。

1.1.3 低氮培养液 Ca(NO3)2·4H2O 0.03 g，CaSO40.46 g，KCl 0.075 g，MgSO4·H2O 0.06 g，K2HPO40.136 g，柠檬酸铁0.075 g，1%Na2MoO31 mL，1%H2BO31 mL，水1 000 mL[2]。

1.1.4 YMA培养基 甘露醇10 g，酵母浸膏 0.5 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，琼脂18 g，水 1000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 根瘤菌的鉴定 采用16S rDNA全序列测定及鉴定。从分离、纯化的蚕豆根瘤菌提取总DNA，通过PCR扩增、电泳技术及凝胶成像，形成指纹图谱，并对PCR产物进行测定。

1.2.2 根瘤菌的回接 ①种子的处理：用75%乙醇浸泡种子5 min后，用无菌水清洗5～8次。将消毒后的种子播于铺有无菌湿润滤纸的平皿内，封好后置于25～28 ℃温箱中保温催芽48 h，种子催芽长为0.5～1.0 cm[3]。② 培养基质处理：将土壤与蛭石按1∶2.0的比例混合拌匀，加入低氮培养液，使蛭石饱和(蛭石和液体的比例为1∶2.5左右)，装入菌袋中，高压灭菌2 h。灭菌后将基质装入花盆，基质界面以距盆口2 cm左右为宜。③菌液制备：将分离纯化的16个蚕豆根瘤菌菌株分别接种于YMA培养基，28 ℃培养72 h。无菌水10 mL将根瘤菌菌体洗下并置于无菌培养皿中，菌悬液调至光密度值为OD=0.8～0.9，待用。④接种：设计16个处理，每处理挑选12粒芽长均为1 cm左右发芽一致的蚕豆种子。置于根瘤菌液中，浸泡15～30 min(以淹没种子为宜)，用

无菌镊子将其植入装有无菌蛭石的花盆中，每盆种植3粒,再沿各种子根部加入该菌液2 mL；对照(CK)选12粒发芽一致的蚕豆种子用无菌水浸泡相同的时间，用无菌镊子将其植入装有无菌蛭石的花盆中。共17个处理，4次重复。培养温度为(22±2) ℃，光强7 000～8 000 lx，光照时间16 h，根据花盆中失水状况适期在托盘中补充水分。

1.2.3 调查指标与方法 ①调查指标：试验培养30～40 d后收获，调查其株高、根长、根瘤数量、地上部鲜重、干重等。②植株全氮量的测定：采用凯氏定氮法。

1.2.4 试验数据分析方法 用Excel软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 根瘤菌的鉴定

16S rDNA全序列测定鉴定结果表明，蚕豆根瘤菌的16个代表菌株均位于快生根瘤菌属(Rhizobium)系统发育分支，相似性均大于98.00%，在98.76%～99.93%之间[4-6]。

2.2 回接试验

2.2.1 蚕豆接种根瘤菌后生物学产量、结瘤情况 结果见表1。

表1 接种不同根瘤菌对蚕豆根瘤及生物量的影响Table 1 Effects of different root nodules on the root nodules and biomass of broad bean

注：同列数据后标不同字母a、b、c、d表示差异达显著水平(P<0.05)

接种根瘤菌处理除菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1外，接种其余菌株的蚕豆株高、根长、单株根瘤数、单株瘤重、地上部鲜重、地上部干重均高于CK(不接种根瘤)，其中菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、6-6-4-1单株根瘤数、单株瘤重增加较多，单株根瘤数比CK分别增加95.64%、97.36%、94.65%、94.58%、93.79%、93.86%；菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、5-5-4-2、6-6-4-1单株地上部鲜重比CK分别增加39.22%、29.00%、30.65%、27.17%、22.32%、42.40%、43.17%；地上部干重比CK分别增加41.85%、19.55%、32.49%、33.33%、26.96%、30.97%、43.98%。

2.2.2 蚕豆接种效应各因素间的相关性研究 结果见表2。

表2 接种效应各因素间的相关性分析Table 2 Correlation analysis of the factors of vaccination effect

表2结果表明，根瘤数量与根瘤重、地上部鲜重与地上部干重之间具有显著正相关，相关系数分别为0.852、0.792，说明这几个指标对蚕豆接种效应的影响更为明显；地上部鲜重、地上部干重在本研究中与根瘤数、根瘤重之间的相关性没有达到显著水平。

2.2.3 初筛结瘤能力强的蚕豆根瘤菌菌株 回接试验结果见表1，初步筛选出促生能力好、结瘤能力强的6株蚕豆根瘤菌株，初筛出菌株的名称及来源见表3。根据盆栽试验结果可知，除CK(不接种根瘤菌)、菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1结瘤少外，分离纯化的14株蚕豆根瘤菌纯培养物回接结瘤率为87.5%，由此说明，回接试验为判定是否根瘤菌的主要依据。

2.2.4 接种根瘤菌对蚕豆固氮的影响 对盆栽试验蚕豆地上部分植株全氮含量进行测定[7](见表4)，计算地上部分氮携出，结果显示，蚕豆接种根瘤菌，蚕豆地上部分氮携出量与CK相比均显著增加，增幅为14.97%～55.33%，其中菌株3-10-1-1、2-2-2-1氮携出量最多，分别为50.01%、47.82%[8-9]。

表3 初筛出蚕豆根瘤菌株的名称及来源Table 3 The name and source of the initial screening of the strain of the bean root nodules

表4 不同根瘤菌株对蚕豆植株中氮携出量的影响Table 4 Effect of different root nodules on the nitrogen content of the broad bean plant

3 讨 论

经分离、纯化、生物鉴定得到的16株菌株，除CK(不接种根瘤菌)、菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1结瘤少外，分离纯化的14个蚕豆根瘤菌纯培养物，回接结瘤率为87.5%。根瘤数量做为考察接种效应的一个重要指标。接种根瘤菌处理除菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1处理外，其余菌株蚕豆单株根瘤数、单株瘤重均高于CK(不接种根瘤菌)，其中菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、6-6-4-1单株根瘤数、单株瘤重增加较多。蚕豆接种根瘤菌后地上部分氮携出量也显著增加。

根瘤菌-蚕豆共生体系能否高效地固氮除与双方的基因有关外,还与土壤、环境条件等密切相关[10-11]，根瘤菌的有效性还要受到土壤生态环境、宿主植物和土著根瘤菌等环境因子的影响[12-13]。在人工控制条件下，温度、湿度以及光照都可以控制，蚕豆接种后，地上部鲜重、干重、根瘤数、氮携出量等差异较为明显。与蛭石相比，土壤条件要复杂得多。因此，在蛭石初筛的基础上，应进一步在土壤中做验证试验，筛选的根瘤菌才能充分发挥其高效共生固氮作用[14]。

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Rhizobium Inoculation Effect on Broad Bean (Viciafaba)

HAN Mei1, ZHANG Hong-liang1, CAO Wei-dong2

(1.Inst.ofSoil&Fertil.,QinghaiAcad.ofAgric. &Forest.Scis.,Xining810016;2.KeyLab.ofPlantNutrit'n&Fertil.,Minist.ofAgric.,Beijing100081)

In order to explore and exploit broad bean (Viciafaba)Rhizobiumexcellent germ plasm in the cold area of Qinghai, and to determine theRhizobiuminoculation effects, 16 isolated, purified, and molecularly characterized broad bean rhizobia strains were screened by pot-back test method in this study. The results showed that six rhizobia strains were screened out, they match well symbiotically with Qinghai No 13 broad bean, and had strong symbiotic nitrogen fixation capacity, and had obvious promotion of growth effects of the broad bean.

broad beanRhizobium; inoculation; nitrogen fixation

青海大学中青年基金项目(2013-QNY-2)；国家农作物种质资源平台运行服务项目(2012)；作物种质资源保护和利用项

韩梅 女，副研究员。主要从事耕作与绿肥等方面的研究与推广工作。E-mail：hanmei20061234@sina.com

2015-08-07；

2015-11-03

Q939.96;S144.3

A

1005-7021(2016)03-0039-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.007

目(NB2013-2130135)；公益性行业(农业)科研专项(201103005)