光合细菌的分离、保存及其同化磷能力研究

陈丽媛， 张庆华， 徐 冲， 陈 杰， 孙翠焕

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

光合细菌的分离、保存及其同化磷能力研究

陈丽媛， 张庆华*， 徐 冲， 陈 杰， 孙翠焕

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

为了研究光合细菌的保藏方法及其同化磷能力，采用液体种室内自然放置、液体种蜡封和穿刺物蜡封等方法对光合细菌进行保藏方法研究，结果表明，液体种蜡封和穿刺物蜡封可作为该菌种的长期保存方法；对两株菌的磷同化能力进行了比较，降解率分别为22%和15%。本研究为获得光合细菌的长期保存方法及其在污水净化中的应用提供参考。

光合细菌；红假单胞菌；分离；菌种保存；解磷

光合细菌(Photosynthetic bacteria)是一大类能进行不产氧光合作用的细菌，由于其具有能利用有机小分子作为碳源的生理特性，且菌体本身具有无毒无害、营养丰富的特点，因此在水产养殖、废水处理等行业得到了广泛应用[1-2]。磷为控制水体藻类生长速度的重要限制因子，是水体富营养化的重要指标，因而利用生物法除去或减少水体中的磷元素越来越受到重视。同时光合细菌具有生物固氮和产生氢气等作用，随着人类面临环境恶化和能源缺乏等危机日益加重，目前光合细菌已成为国内外研究开发应用的重要微生物资源[3-5]。本研究从菌种保存方法及其同化磷能力等方面对光合细菌进行初步研究，旨在为获得光合细菌的长期保存方法及为光合细菌在污水净化中的应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 光合细菌培养液由沈阳农业大学赠送(菌液中菌体分布不均匀，有下沉和趋壁现象)。

1.1.2 培养基[6-7]①富集培养基：Van niel培养基，pH 7.0～7.5，115 ℃灭菌30 min。②种子培养基及液体培养基[8]：均采用“光合细菌质量标准”中的培养基，pH 7.0～7.5，115 ℃灭菌30 min。③分离培养及穿刺培养基：均采用半固体培养基，即在富集培养基的基础上添加0.8%琼脂，pH 7.0～7.5，115 ℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 富集培养 取少量光合细菌样品于装有液体培养基的带塞三角瓶中，接种后再用灭菌的培养基装满三角瓶，塞紧瓶塞，培养条件为温度30 ℃、光强1 500～2 000 lx、培养时间5～7 d，静止培养，当培养液呈现出红色、褐色、紫色和橙色等特征颜色时，培养结束。再按上述步骤重复2次，使菌种复壮。

1.2.2 分离方法 平板划线法。温度30 ℃、光强1 500～2 000 lx、培养时间5～7 d，长出单菌落后，将单菌落再划线2～3次得到纯菌种。

1.2.3 种子培养 将纯化后的菌种接种于种子培养液中，30 ℃、1 500～2 000 lx光照下培养5～7 d，备用。

1.2.4 液体培养 按体积分数2%的接种量将种子培养液接种于液体培养基中，30 ℃、1 500～2 000 lx光照下培养5～7 d，备用。

1.2.5 形态观察 将纯培养物接种于液体培养基中，光照、厌氧条件下培养3～5 d，对菌体进行革兰染色，观察菌体形态、繁殖方式、鞭毛及运动。将培养物在平板培养基上划线，进行厌氧、光照培养，观察菌落形态。

1.2.6 菌种保存试验[8-9]①液体菌种自然条件下保存：将培养好的光合细菌菌液置于室内自然条件下，每隔2个月取样1次，接种于液体培养基中，通过培养时间及外观变化考察其存活状况。②液体菌种蜡封保存：用15 mm×150 mm试管装入约30 mm高的光合细菌菌液，上面覆盖1层约20 mm高的无菌混合石蜡，然后置于干燥器中，每隔2个月取1次样，通过菌数、感观指标和pH值等，考察其活性变化。③穿刺物蜡封保存试验：挑

选培养好的、生长丰满的穿刺培养物，在琼脂柱上覆盖1层20 mm厚的无菌混合石蜡，胶塞上封1层固体石蜡，置于干燥器或冰箱中保存，每隔2个月取1次样，挑出琼脂柱中的穿刺培养物，接种于培养基中进行培养，同时以不做蜡封的穿刺菌种做对照，考察其存活状况。

1.2.7 含磷量的测定 钼蓝比色法[10-12]。

2 结果与分析

2.1 光合细菌的分离及

利用平板划线法分离到2株菌，编号为PBS-01、PBS-02，其菌株培养特征及光照厌氧培养特征见表1，菌落特征见表2，碳源及氮源利用情况见表3。

表1 菌株PBS01及PBS02形态及厌氧培养特征Table 1 Morphology and anaerobic cultivation features of strain PBS01 and PBS02

表2 菌株PBS01及PBS02黑暗好气培养菌落特征Table 2 Colony features in dark and aerobic cultivation of strain PBS01 and PBS02

表3 菌株PBS01及PBS02碳源及氮源利用情况Table 3 Application of carbon and nitrogen source in bacteria strain PBS01 and PBS02

注：“-” 表示不利用；“+”表示利用率不高；“++”表示利用率较好；“+++”表示利用率很高

通过菌株PBS01及PBS02的培养培养特征及生理生化特征，初步鉴定为红假单胞菌属。

2.2 光合细菌菌种保存效果实验

2.2.1 液体菌种自然条件下保存 将光合细菌菌液置于室内自然条件下一年后仍能存活，但活性很弱。室内放置2个月后，菌体便下沉。但由于这种方法非常简便，能用于短时间菌种保存，为防止菌种退化，2个月重新转接1次。光合细菌菌液放置过程中的变化见表4。

表4 光合细菌菌液放置过程中的外观及活性变化Table 4 Appearance and activities changes of photosynthetic bacterial liquid during placement

2.2.2 穿刺物蜡封保存试验 待穿刺菌种长满后，用液体石蜡密封，置于冰箱或干燥器中，其存活情况见表5，以穿刺保存法作对照。

2.2.3 液体菌种蜡封保存 将光合细菌菌液置于试管中，并在菌液上覆盖一层液体石蜡，塞上橡皮塞，置于干燥器中，对其存活状况检测结果见表6。通过菌数测定及培养观察，活性较好。液体蜡封保存光合细菌可以保存一年，可作为光合细菌的长期保存方法。

2.3 PSB01和PSB02对磷的利用试验

将液体培养基装入具塞三角瓶中，装量为80 mL/250 mL，接种量为10%，不接菌为对照(CK)，在30 ℃光照微好氧和黑暗微好氧状态下各培养5 d，将培养液离心，利用钼蓝法测培养前后磷的变化。通过测定培养前后菌液的OD值，计算菌液对无机磷的降解率。公式如下：

实验进行3次重复，取3次平均值为实验结果(见表7)。

从以上实验结果得出，穿刺蜡封保存菌种的效果明显好于穿刺保存，可作为光合细菌的长期保存方法。

表5 穿刺物蜡封保存菌种活性检测结果Table 5 Activities determination results of strain seed in wax-sealed preservation of puncturing

注：“+”表示接种5～7 d后，菌液变成深红色；“-”表示菌种已出现退化现象

表6 液体菌种蜡封保存活性检测结果Table 6 Activities determination results of liquid strain seed in wax-sealed preservation

表7 菌株PBS01及PBS02对无机磷的降解率Table 7 Inorganic phosphorus degradation rate of strain PBS01 and PBS02

3 讨 论

从光合细菌样品中分离出2株菌，初步鉴定为红假单胞菌。研究结果表明，光合细菌菌液在室温自然条件下保存，每2个月转接1次，可作为短期保存方法；液体蜡封保存和穿刺蜡封保存光合细菌，保存期为1年，可作为长期保存光合细菌的方法。

2株菌在光照微好氧和黑暗微好氧状态下都能同化磷，光照微好氧同化磷的效果好于黑暗微好氧。在光照微好氧状态下，两株菌对磷的降解率分别为22%和15%。本研究只是以无机磷为底物，未涉及利用光合细菌处理污水试验，PSB01和PSB02净化水质能力有待于进一步研究。

光合细菌做为一种古老的光能自养菌，在人们的生产生活方面具有重要作用，且逐渐被人们广泛应用，特别是在水产养殖及环境治理方面发挥着重要作用[13-16]。目前，随着分子生物学研究的深入，筛选组建高效专一的新菌株成为光合细菌对环境修复的主要发展方向。

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Isolation, Preservation, and Phosphorus Assimilation of Photosynthetic Bacteria

CHEN Li-yuan, ZHANG Qing-hua, XU Chong, CHEN Jie, SUN Cui-huan

(LiaoningAcad.ofMicrobiol.,Chaoyang122000)

In order to study the method to preserve photosynthetic bacteria as well as their phosphorus assimilation capability, natural placement of liquid strain seed indoor, wax-sealed liquid strain seed preservation, as well as wax-sealed preservation methods of puncturing were adopted to carry out the study. The results showed that preservation methods with wax-sealing of liquid strain seed and wax-sealing of puncturing could be used as long-term preservation methods. The phosphorus assimilation of both strains was compared; the degradation rates were 22% and 15% respectively. This study provided some references to obtain long-term preservation methods for photosynthetic bacteria, and their application in sewage water purification.

photosynthetic bacteria;Rhodopseudomonas; isolation; strain seed preservation; phosphorus degradation

国家农业科技成果转化项目(国科发[2010]297号)

陈丽媛 女，副研究员。主要从事应用微生物学研究。E-mail:cly6585@163.com

* 通讯作者。女，研究员。主要从事微生物菌种选育及发酵技术研究。Tel:0421-2976855,E-mail:zhang_qinghua@126.com

2015-12-25；

2016-01-16

Q939.96

A

1005-7021(2016)03-0043-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.008