AKT-GSK-3β信号途径在下调肝癌细胞化疗敏感性中的作用研究

郭佳培，吴景华，李雷雷，郭 彬

（华北理工大学附属医院检验科，河北唐山063000）

·基础研究·

AKT-GSK-3β信号途径在下调肝癌细胞化疗敏感性中的作用研究

郭佳培，吴景华，李雷雷，郭 彬

（华北理工大学附属医院检验科，河北唐山063000）

目的观察AKT-GSK-3β信号转导通路对化疗后肝癌细胞凋亡的影响，进一步探讨该通路在肝癌细胞化疗敏感性中的调控作用。方法应用细胞培养与Western blot技术，检测肝癌细胞化疗后凋亡情况并分析其与AKT-GSK-3β信号通路活化的关系，通过特异性阻断信号通路方法，对AKT-GSK-3β通路调节肝癌细胞化疗敏感性进行验证。结果肝癌细胞经奥沙利铂化疗后发生凋亡，表现为BAX蛋白表达增加和Bcl-2蛋白表达减少，同时AKT-GSK-3β通路磷酸化激活。阻断该通路后，化疗后肝癌细胞凋亡明显增加。结论AKT-GSK-3β信号途径可以下调肝癌细胞化疗敏感性，与其化疗效果有密切联系。

AKT-GSK-3β； 肝癌； 化疗； 凋亡； 敏感性

肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，进展迅速，病死率极高，在癌症死因中位居第二位[1]。发达国家仅有20%～30%的患者可在早期确诊并手术治疗[2]，对于中晚期患者多应用化疗。奥沙利铂由于副作用少在临床上得到广泛应用，然而由于肝癌细胞的化疗抵抗现象，治疗效果并不十分理想。因此，减少化疗抵抗是提高肝癌系统治疗效果的一个关键问题。糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是PI3K／AKT信号通路中重要的具有调节细胞增殖、分化、凋亡等功能的调节分子，该通路与抑制细胞凋亡及促进增殖密切相关。为了研究肝癌化疗抵抗与GSKS-3β之间的关系，本文将从细胞及分子水平进行分析，进一步探究AKT-GSK-3β信号途径在下调肝癌细胞化疗敏感性中的作用及机制。

材料和方法

1 研究对象

SMMC-7721传代肝癌细胞（上海细胞库）、HepG2传代肝癌细胞（上海细胞库）。

2 主要试验仪器与试剂

生物安全柜、细胞培养箱、离心机、电泳仪（Biorad）、Image Lab凝胶成像系统（Bio-rad）、高糖DMEM（Gibco，美国）、胎牛血清（BI，美国）、0．25%胰蛋白酶、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（索来宝，北京）、0．45nm PVDF膜、脱脂奶粉、蛋白上样缓冲液（索来宝，北京）、ECL发光显影液（索来宝，北京）。

3 研究方法

3．1 肝癌细胞培养 采用高糖DMEM和10%胎牛血清加青链霉素混合液制成完全培养液，于37℃5%CO2培养箱中培养SMMC-7721和HepG2细胞。取对数生长期细胞进行试验。

3．2 奥沙利铂作用后肝癌细胞凋亡的检测

取对数生长期的SMMC-7721和HepG2细胞分别制成细胞悬液，以2．5×105个／孔数量加入六孔板中。细胞融合率50%～70%时，以20μg／mL奥沙利铂分别作用18h。Western blot检测肝癌细胞中Bcl-2、BAX蛋白的表达情况。

3．3 检测奥沙利铂作用下肝癌细胞AKT／GSK-3β通路的激活情况 按上述步骤以奥沙利铂作用肝癌细胞，Western-blot检测总 AKT、p-AKT及p-GSK-3β蛋白的表达情况。

3．4 阻断通路后肝癌细胞的凋亡情况 于奥沙利铂作用前1h应用PI3K／AKT特异抑制剂LY294002阻断该通路后，按上述步骤以奥沙利铂作用肝癌细胞，再次行Western-blot检测肝癌细胞中Bcl-2、BAX蛋白的表达情况，以观察AKT／GSK-3β信号通路对化疗效果的影响。

4 统计学处理

Western-blot检测图像用Image Lab化学发光成像系统处理并计算灰度值；采用SPSS17．0对数据进行统计学分析。资料经检验均服从正态分布，用±s表示。采用两独立样本t检验和完全随机设计方差分析统计灰度值。所有结果以P＜0．05有统计学意义。

结 果

1 奥沙利铂诱导肝癌细胞凋亡情况

取经奥沙利铂作用的细胞，提取细胞总蛋白，进行Western blot检测。结果显示，肝癌细胞SMMC-7721及HepG2经奥沙利铂化疗后，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低，凋亡相关蛋白BAX表达明显升高。统计分析其灰度值，Bcl-2和BAX的改变均有显著性统计学意义（P＜0．01）见图1。

2 奥沙利铂诱导AKT／GSK-3β信号通路蛋白表达情况

经奥沙利铂作用后，肝癌细胞中SMMC-7721及Hep G2 AKT蛋白表达水平没有明显（P＞0．05），而p-AKT和p-GSK-3βser9蛋白表达增加（P＜0．01），说明奥沙利铂可以诱导该通路活化。见图2。

3 AKT／GSK-3β信号通路影响肝癌细胞化疗敏感性的情况

应用 AKT／GSK-3β特异阻断剂 LY294002阻断该通路后，奥沙利铂作用的肝癌细胞凋亡蛋白BAX表达明显增加（P＜0．01），而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少（P＜0．05），说明奥沙利铂作用后AKT／GSK-3β信号通路的激活明显抑制了其凋亡敏感性。见图3。

讨 论

肝癌是全球最常见的肿瘤之一，且发病率逐年增加。通常肝癌确诊时已发展至晚期，手术疗效不佳。尽管索拉菲尼可提高晚期患者生存率已被肯定，但此几率极低（2%～3%）；并且，已有研究指出PI3K／AKT通路可介导肝癌细胞对索拉菲尼产生抵抗。因此，肝癌患者对化疗产生抵抗的机制及新的治疗方法仍需探究[3]。

PI3K／AKT通路是包括肝癌在内的人类肿瘤中主要信号通路之一，细胞静止时，AKT位于胞浆内；细胞受生长因子等刺激后，AKT由胞浆转移至胞膜内侧，PH域与PlS结合，暴露磷酸化位点，被 PDK-1激活后离开细胞膜进入细胞核发挥作用。PI3K／AKT信号转导通路主要作用包括促进细胞增长、抑制细胞凋亡和下调细胞周期抑制性调控因子，与乳腺癌、卵巢癌、肝癌、大肠癌等多种肿瘤关系密切。其中GSK-3β蛋白是PI3K／AKT信号通路中的重要节点蛋白，GSK-3β在许多肿瘤细胞和人类肿瘤组织中高表达[4]。GSK-3β在静止细胞中一般较活跃，受磷酸化修饰调节，9位丝氨酸的磷酸化使其活性受抑制。GSK-3β磷酸化活化后，可降解抗凋亡蛋白Bcl-2，从而增加细胞凋亡。随着与 GSK-3β相互作用分子的不断发现，GSK-3β在肿瘤形成中的重要作用受到越来越多的关注。本次研究发现，肝癌细胞经奥沙利铂化疗后，AKT被激活，GSK-3β 9位丝氨酸磷酸化增加，GSK-3β活性被抑制，使Bcl-2降解减少，细胞凋亡减少。相反，LY294002特异性阻断AKT活性后，细胞凋亡明显增加，可见肝癌细胞对奥沙利铂的敏感性与该通路有某种联系，即化疗后AKT／GSK-3β信号转导通路的活化可抑制肝癌细胞凋亡，表明该通路可调节细胞对化疗药的敏感性，与化疗后肝癌细胞的生长和患者生存期和复发率密切相关。这与Soto-Cerrato等[5]研究结果一致。另外，LY294002本身并不会引起细胞凋亡，特异性阻断AKT／GSK-3β信号通路后，凋亡蛋白表达增加，而抗凋亡蛋白明显减少，提示两种肝癌细胞凋亡均显著增加，说明干扰AKT／GSK-3β的表达可诱导肝癌细胞凋亡的发生，这与Dan[6]研究结果一致。

综上，AKT／GSK-3β信号途径可使肝癌细胞抵抗化疗引起的凋亡，抑制该通路可提高肝癌细胞化疗敏感性。

[1]Jemal A，Bray F，Center M M，et al．Global cancer statistics．CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90．

[2]Xiu P，Dong X F，Li X P，et al．Clusterin：Review of research progress and looking ahead to direction in hepatocellular carcinoma．World J Gastroenterol，2015，21（27）：8262-8270．

[3]Du H，Yang W，Chen L，et al．Role of autophagy in resistance to oxaliplatin in hepatocellular carcinoma cells．Oncol Rep，2012，27（1）：143-150．

[4]Chiara F，Rasola A．GSK-3 and mitochondria in cancer cells．Front Oncol，2013，3：16．

[5]Soto-Cerrato V，Viñals F，Lambert J R，et al．Prodigiosin induces the proapoptotic gene NAG-1 via glycogen synthase kinase-3beta activity in human breast cancer cells．Mol Cancer Ther，2007，6（1）：362-369．

[6]Dan S，Yoshimi H，Okamura M，et al．Inhibition of PI3K by ZSTK474 suppressed tumor growth not via apoptosis but G0／G1 arrest．Biochem Biophys Res Commun，2009，379（1）：104-109．

（潘子昂编辑）

Effect of AKT-GSK-3β Signaling Pathway on Down-regulating Chemo-sensitivity of Hepatocellular Carcinoma

GUO Jia-pei，WU Jing-hua，LI Lei-lei，GUO Bin
（Clinical Laboratory of Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of AKT-GSK-3β signaling pathway on hepatocellular carcinoma cell apoptosis after chemotherapy．MethodsCell culture and western blot were used to detect apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by oxaliplatin，and the relationship between apoptosis and AKT-GSK-3β signaling pathway activation were analyzed．Through inhibiting signaling pathway specifically，regulation effects of AKT-GSK-3β signaling pathway on sensitivity of hepatocellular carcinoma cells to chemotherapy was verified．ResultsHepatocellular carcinoma cells appeared apoptosis after chemotherapy，showing increase of BAX protein and decrease of Bcl-2 protein as well as phosphorylation of AKT-GSK-3β signaling pathway．However，Hepatocellular carcinoma cells apoptosis increased obviously after chemotherapy．ConclusionAKTGSK-3β signaling pathway could down-regulate sensitivity of hepatocellular carcinoma cells to chemotherapy and may have closely relationship with therapeutic effect．

AKT-GSK-3β； Hepatocellular carcinoma； Chemotherapy； Apoptosis； Sensitivity

10．11748／bjmy．issn．1006－1703．2016．03．025

2015-10-09；

2015-11-22

郭佳培（1991—），女，在读医学硕士。研究方向：肿瘤免疫。

吴景华（1976—），医学博士，副教授，硕士生导师。研究方向：肿瘤免疫。E-mail：tswujinghua＠163．com