丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法化学发光检测的应用

周齐洋，张娜娜

（1．江苏省医疗器械检验所，江苏南京210012；2．苏州长光华医生物医学工程有限公司，江苏苏州215163）

丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法化学发光检测的应用

周齐洋1，张娜娜2

（1．江苏省医疗器械检验所，江苏南京210012；2．苏州长光华医生物医学工程有限公司，江苏苏州215163）

目的探讨丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法化学发光检测的应用。方法利用重组融合HCV抗原分别标记生物素及吖啶酯，建立起双抗原夹心法化学发光检测试剂盒，与间接法同时检测了866例阴性标本，440例阳性标本，3套BBI阳转血清盘。结果双抗原夹心法与间接法灵敏度分别为100%、100%，特异性分别为99．9%、98．7%，特异性差别1．2%（95%可信区间：0．5%～2．1%），BBI阳转血清相对敏感性系数为－1．33。结论双抗原夹心法特异性及早期感染检测能力优于间接法，将会成为丙型肝炎病毒抗体检测的主要方法。

丙型肝炎病毒抗体； 双抗原夹心法； 化学发光

丙型肝炎病毒（HCV）感染呈世界性分布，我国感染者约有4000万。丙型肝炎病毒抗体是丙型肝炎病毒感染机体后出现的特异性抗体[1]，目前常用的丙型肝炎病毒抗体（Anti-HCV）检测方法主要有酶联免疫法、化学发光法和时间分辨荧光免疫分析法，但均采用间接法检测，但由于间接法存在假阳性率高的不足，增加了临床检验成本，也造成患者不必要的精神负担。建立一种高特异性高灵敏性的Anti-HCV检测方法尤其重要。本文利用重组融合HCV抗原一种标记生物素、一种标记吖啶酯，利用双抗原夹心原理建立起吖啶酯化学发光检测方法，并与间接法化学发光检测试剂盒同时检测866例阴性标本、440例阳性标本及3套阳转血清盘。研究两者在特异性、灵敏度及早期感染检测能力方面的差异。

材料和方法

1 材料

1．1 主要试剂 两种重组融合HCV抗原（包含core、NS3、NS5片段）购自芬兰Hytest公司；吖啶酯及生物素购自Sigma公司；化学发光激发液1、化学发光激发液2及亲和素磁颗粒由苏州长光华医生物医学工程有限公司提供；间接法化学发光检测试剂盒由Abbott公司生产的丙型肝炎病毒抗体测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）。

1．2 标本来源 标本来源于东南大学医学院附属江阴医院、吉林大学第一医院、北华大学附属医院3家医院，其中阴性标本包含老年人、乙型肝炎病毒阳性、戊型肝炎病毒阳性、梅毒抗体阳性、类风湿患者等具有干扰性质的标本；所有阳性标本来自中检血清盘及经临床诊断确认的丙肝患者血清；阳转血清盘购自BBI公司，CatNo：PHV906、PHV919、PHV924。

2 方法

2．1 吖啶酯标记抗原的制备 取一定量重组融合HCV抗原，采用 0．05mol／L pH9．5 CB调整浓度为1mg／mL；按抗原∶吖啶酯 ＝1∶10～20摩尔比加入已活化吖啶酯，室温反应0．5～1．0h；将反应液移至透析袋（截留分子量8000～12000），采用0．05mol／L pH9．5 CB透析24h，加入等量甘油，放置－20℃以下保存。

2．2 生物素标记抗原的制备 取一定量重组融合HCV抗原，采用 0．05mol／L pH9．5 CB调整浓度为1mg／mL；按抗体：生物素＝1：10～20摩尔比加入已活化生物素，室温反应0．5～1．0h；将反应液移至透析袋（截留分子量8000～12000），采用0．05mol／L pH9．5 CB透析24h，加入等量甘油，放置－20℃以下保存。

2．3 操作步骤 第一步反应：将样本和生物素标记重组丙型肝炎抗原及吖啶酯标记重组丙型肝炎抗原进行反应后，形成抗原－抗体－抗原夹心复合体。再加入链霉亲和素磁微粒，复合体在链霉亲和素和生物素相互作用下形成固相。再将反应液置于一个磁场内，检测中的磁微粒将被吸附，通过洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液1及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度，根据临界值判定样本中是否含有Anti-HCV，样本的RLU值随Anti-HCV浓度的增加而升高。

2．4 特异性及灵敏度试验方法 采用两种检测方法对所选择标本进行同步盲法检测，对两者不符的标本采用RIBA确认试剂进行确认。试验结束后揭盲，对试验结果采用EXCEL软件进行比对分析统计，计算两种方法临床诊断灵敏度及特异性、两者之间差别及95%可信区间[2]。

2．5 阳转血清相对敏感性系数试验方法 采用本方法对3套阳转血清盘进行检测，根据检测结果，并参照WHO对阳转血清相对敏感系数的计算方法来评估本方法对HCV早期感染的能力。

结 果

1 特异性及灵敏度

采用两种检测方法同步对866例阴性标本，440例阳性标本进行检测，对11例不确定标本，均采用RIBA确认试剂进行确认为阴性。结果显示在诊断灵敏度上，两种检测方法无差别，由于特异性的置信限不包括“0”，有证据说明两种检测方法特异性有差别。并采用EXCEL软件统计分析两种方法特异性及灵敏度、两者的差别及95%可信区间。结果见表1。

表1 两种检测方法结果统计情况

2 阳转血清相对敏感性系数

以Abbott公司的Architect HCV为对照，分析本方法的阳转血清相对敏感性系数。对每一阳转血清盘，对照试剂检出的第一份系列血清定为0，将本方法检测结果与其作对比，确定本方法的第一份系列血清与对照试剂的0血清的位置关系。对任一阳转血清盘而言，若本方法检测出第一份为阳性的样品的位置在对照试剂的0血清位置前2位，则该转血清盘的相对敏感性系数为-2。反之，若在对照试剂的0血清位置后3位，则相对敏感性系数为＋3。求出3套血清盘相对敏感性系数的均值，以此来评价试剂对窗口期样品的检测能力，数值越小，试剂越灵敏。统计结果为-1．33。实验结果见表2。

表2 阳转血清相对敏感系数统计结果

讨 论

丙型肝炎呈全球性流行，全球HCV的感染率约为3%，我国一般人群 Anti-HCV阳性率为3．2%，丙型肝炎慢性化率为50%～85%，慢性丙型肝炎的肝硬化率为10%～15%，失代偿期肝硬化的10年生存率仅为25%，慢性丙型肝炎导致的肝硬化患者中，每年肝癌发生率为1%～7%[3]。HCV常呈隐匿性感染，容易被忽视。一旦感染HCV，病程越长，越难治愈；慢性丙型肝炎可逐渐进展成肝硬化、肝细胞癌等严重肝脏疾患，从而造成沉重的身心负担，故应重视丙型肝炎的筛查[4]。丙型肝炎已有有效的治疗药物，如能及早治疗，可防止其发展为肝硬化和肝癌。对丙型肝炎早期筛查、早期诊断、早期治疗十分重要[5]。因此，研制一种高灵敏度、高特异的试剂盒对丙型肝炎的防治有着重要的意义。

目前临床检测 Anti-HCV方法原理多为间接法[6]，即采用了抗人IgG与示踪物联接作为标志物，此种检测原理由于血清中IgG含量高，故少量的非特异吸附即易造成假阳性结果，血清中类风湿因子等也可能干扰检测结果。虽然，目前间接法检测技术已更新至第三代，其特异性达到99%以上，但仍有研究表明，在Anti-HVC流行率＜10%的免疫活性人群中，HCV EIA2．0和HCV ELISA3．0的假阳性率平均约为35%（15%～60%）[7]。双抗原夹心法由于采用两种重组抗原分别标记生物素及吖啶酯，从而有效杜绝IgG及类风湿因子的影响，从而提高临床诊断特异性。从本文实验结果也证实了此差别。

双抗原夹心法检测的是血清中总抗体，包含IgG抗体和IgM抗体，且不受不同患者对HCV反应时产生不同IgG亚型的限制，这有别于多数间接法仅能检测IgG抗体。Anti-HCV IgG在丙型肝炎患者血清中出现较晚。虽然Anti-HCV IgM不仅存在急性HCV感染者，而且在慢性HCV感染者亦有较高检出率，不能作为急性感染的指标，但IgM检测有利于急性感染的辅助诊断，因此双抗原夹心法有利于提高早期感染的检出率，缩短病毒感染检出的“窗口期 ”[8-10]。

本文研究表明，丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的特异性要优于传统间接法检测，其早期感染检测能力同样优于间接法，将会成为丙型肝炎病毒抗体检测的主要方法学。

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[4]石爽，庄辉．重视丙型肝炎的筛查．肝脏，2007，12（5）：333-335．

[5]胡佳林，张世勇．3953例丙型肝炎病毒抗体检测结果及分析．检验医学与临床，2008，5（15）：944-945．

[6]谢立，吴晓东．丙型肝炎病毒检测方法的研究进展及其临床意义．世界华人消化杂志，2005，13（7）：884-886．

[7]屠宇平，杨小平．实验室检测丙型肝炎病毒抗体及结果报告指南．疾病监测，2003，18（6）：235-238．

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[9]王国华，张贺秋，李少波，等．双抗原夹心与间接ELISA法检测抗HCV对比研究．中国医学检验杂志，2005，6（4）：318-319，341．

[10]陈坤，张贺秋，宋晓国，等．双抗原夹心酶联免疫技术检测丙型肝炎病毒抗体．中国医学检验杂志，2005，6（1）：25，75．

（潘子昂编辑）

Application of Double Antigen Sandwich Chemiluminescence Detection for Hepatitis C Virus Antibody

ZHOU Qi-yang，ZHANG Na-na
（Jiangsu Institute of Medical Device Testing，Nanjing 210012，China）

ObjectiveTo explore the application of double antigen sandwich chemiluminescence detection for hepatitis C virus（HCV）antibody．MethodsTwo recombinant fusion antigens of HCV were labeled with biotin and acridine ester respectively to establish double antigen sandwich method for chemiluminescence detection．866 cases of negative samples，440 cases of positive samples，3 sets of BBI blood liquidation were detected by method developed in this study and indirect method respectively．ResultsBoth double antigen sandwich method and indirect method had a high sensitivity of 100%，and the specificity of double antigen sandwich method was 99．9%，and indirect method was 98．7%，which is 1．2%lower than that of double antigen sandwich method（95%confidence interval：0．5-2．1%）．The Relative sensitivity coefficient of BBI turn-positive serum was-1．33．ConclusionThe specificity and early detection ability of double antigen sandwich method are super than indirect method，and it will become the main detection method for hepatitis C virus antibody detection．

Hepatitis C virus antibody； Double antigen sandwich method； Chemiluminescence

10．11748／bjmy．issn．1006－1703．2016．03．027

2015-10-22；

2015-12-14