市售保健品中7种醒酒护肝功效成分的毛细管电泳测定

s邹海民, 周 琛, 孙成均, 李永新, 杨晓松, 文 君, 曾红燕

(1. 四川大学华西公共卫生学院, 成都 610041; 2. 成都市疾病预防控制中心, 成都 610047)



市售保健品中7种醒酒护肝功效成分的毛细管电泳测定

s邹海民1,2, 周 琛1, 孙成均1, 李永新1, 杨晓松2, 文 君2, 曾红燕1

(1. 四川大学华西公共卫生学院, 成都 610041; 2. 成都市疾病预防控制中心, 成都 610047)

采用胶束电动毛细管电泳-二极管阵列检测器同时检测了市售保健品中儿茶素、 表儿茶素、 表没食子儿茶素、 表儿茶素没食子酸酯、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 二氢杨梅素和甘草酸等7种醒酒护肝功效成分. 采用正交设计法对毛细管电泳条件[缓冲剂浓度、 添加剂十二烷基硫酸钠(SDS)浓度、 添加剂乙腈比例以及电泳缓冲溶液pH]进行了优化. 在优化的条件下, 7种组分在各自的线性范围内相关系数r≥0.9989, 检出限和定量限分别为0.26～2.22 μg/g(S/N=3)和0.87～7.39 μg/g(S/N=10), 日内精密度和日间精密度分别为1.3%～2.5%和1.9%～3.9%, 样品加标回收率为91.4%～104.9%, 加标样品的相对标准偏差(RSD)在1.4%～3.2%之间. 本方法可在8 min内实现7种功效成分的同时检测, 能够满足市售醒酒护肝产品的常规分析和质量评价要求.

胶束电动毛细管电泳; 正交设计; 儿茶素; 二氢杨梅素; 甘草酸

目前, 市售醒酒护肝功能食品多为各种茶叶或其提取物, 其主要成分包括儿茶素类[1]、 二氢杨梅素[2]和甘草酸[3,4]等. 儿茶素类主要包括儿茶素(C)、 表儿茶素(EC)、 表没食子儿茶素(EGC)、 表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)等. 儿茶素类化合物的化学结构中均含有较多的酚羟基[5], 能与体内乙醇代谢过程中产生的自由基结合而将其清除, 具有较好的解酒效果[6]; 该类化合物也有较强的抗氧化能力, 能有效缓解酒精造成的肝脂质过氧化[7]. 二氢杨梅素(DMY)又名蛇葡萄素, 为天然多酚羟基双氢黄酮醇类化合物, 大量存在于葡萄属植物藤茶中. 欧贤红等[8]通过体外实验证实二氢杨梅素能有效清除氧阴离子自由基和羟自由基, 具有较强的抗氧化活性. 甘草酸(GA)是中草药甘草的主要活性成分, 属三萜类化合物. 甘草不仅有抑制肝脏脂质过氧化、 清除自由基和抗肝纤维化的功效[9], 而且在中国传统复方上常作为一味独特的导药, 可协同加强其它组分的功效[10]. 儿茶素类、 二氢杨梅素和甘草酸的常见分析方法有薄层色谱法[11]、 气相色谱法[12]、 高效液相色谱法[13,14]和毛细管电泳法[15,16]等, 其中毛细管电泳分离模式多、 分析速度快、 分离效率高、 消耗样品少且能满足快速分析的需要. 目前文献[1,4,6,15]多只针对某一种或一类醒酒护肝成分进行检测, 而对于黄烷醇类、 黄酮醇类及三萜类等多种成分同时检测的报道较少. 本文采用毛细管电泳法同时测定市售保健品中多种醒酒护肝功效成分. 与传统的高效液相色谱法相比, 本方法具有样品用量少、 分析时间短、 特异性好、 环境污染小、 灵敏度高及重现性好等优点, 可用于批量样品的检测, 能满足市售保健品中多种醒酒护肝功效成分的常规分析和质量评价.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

儿茶素、 表儿茶素、 表没食子儿茶素、 表儿茶素没食子酸酯、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 二氢杨梅素和甘草酸(纯度≥98%, 成都曼思特生物科技有限公司); 四硼酸钠(Na2B4O7, 分析纯, 成都化学试剂厂); 十二烷基硫酸钠(SDS, 分析纯, 天津大茂化学试剂厂); 甲醇(色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司); 乙腈(ACN, 高效液相色谱级, Sigma-Aldrich公司).

P/ACE MDQ型高效毛细管电泳仪, 配有光电二极管阵列检测器(美国Beckman公司); pHS-2C型数字酸度计(成都世纪方舟科技有限公司); BSA224S型电子天平(0.1 mg, 赛多利斯科学仪器有限公司); 754系列紫外-可见分光光度计(美国Labtech公司); KQ-250型超声波清洗器(昆山市淀山湖仪器检测厂).

1.2 溶液配制

将7种标准物质均以甲醇为溶剂配制成1 mg/mL的标准储备液.

标准溶液的配制: 分别吸取一定体积的各标准储备液, 用毛细管电泳缓冲液定容至10 mL, 配制成含GA为400 μg/mL, C, EC, ECG, EGC, EGCG和DMY均为100 μg/mL的混合标准储备液, 使用前用电泳缓冲液进一步稀释成标准系列. 所有标准溶液均需在4 ℃下避光保存, 至少可以稳定30 d.

1.3 实验方法

1.3.1 毛细管电泳实验 毛细管电泳条件: 熔融石英毛细管(50 cm×50 μm, 有效长度为40 cm, 未涂层, Beckman公司); 电泳缓冲液由25 mmol/L Na2B4O7, 35 mmol/L SDS和7%(体积分数)ACN组成, 其pH=7.00, 经0.45 μm微孔滤膜过滤、 超声波脱气10 min后备用; 分离电压为25 kV, 采用光电二极管阵列(PDA)检测器在190～400 nm范围内全扫描检测. GA选择254 nm处色谱峰进行定量分析, 其余组分均选择210 nm; 分析温度为25 ℃; 3.45 kPa压力下进样5 s.

为保证实验结果的重现性, 实验前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、 超纯水和缓冲溶液冲洗毛细管柱3 min; 每次分析结束后用电泳缓冲液冲洗毛细管柱3 min后进行下一次分析; 每进行3次分析后需更换两极电泳缓冲液.

1.3.2 样品前处理 将茶叶、 胶囊等固体样品内容物取出后碾磨成粉, 过100目筛后, 称取1 g, 用25 mL 80%(体积分数)的甲醇溶液超声提取30 min; 直接吸取1.00 mL液态样品用甲醇溶液定容至5.00 mL. 所有样品溶液均以10000 r/min转速离心10 min, 取上层清液设定的电泳条件进样分析.

2 结果与讨论

2.1 毛细管电泳条件的优化

Fig.1 Electrophoretograms of 7 components in mixed standard solution with orthogonal experiment of L9(34)

Fig.2 Electrophoretograms of mixed standard solution(a) and sample 2#(b)

影响毛细管电泳分离效果的因素较多, 正交设计法能同时考虑多个因素的交互作用, 具有简便、 直观且快速等优点. 本文在单因素预实验的基础上, 采用正交设计法进一步优化以期获得最佳分离条件. 选取对各组分分离度影响较大的4个因素: 缓冲液硼砂浓度(20, 25和30 mmol/L)、 添加剂SDS浓度(25, 30和35 mmol/L)、 添加剂乙腈比例(5%, 7%和9%, 体积分数)以及电泳缓冲液pH(6.80, 7.00, 7.20), 进行L9(34)正交实验设计, 各因素组合条件实验见表S1(见本文支持信息).

各次条件实验结果如图1所示, 由于7种组分的出峰时间均较短能满足分析要求, 因此本文仅以难分离对EGC/C, C/EC, EGCG/ECG和ECG/DMY的分离度(Rs)作为评定条件实验效能的标准, 采用SPSS 17.0软件进行统计分析(结果见表S1). 每个水平i(i=1, 2, 3)的平均分离度值Ki和极差R的计算公式如下:

Ki=$∑$R\%s\%i/3,R=Kmax-Kmin

式中,Kmax代表Ki的最大值;Kmin代表Ki的最小值.

Kmax代表的i水平是能获得最大分离度的条件, 不同分离因素所计算出的R值不同,R值越大则表示该因素对难分离组分的分离度影响越大, 反之亦然.

由图1可见, 在9次实验中, 7种组分出峰时间均小于8 min, 其中第2, 3, 6和9次实验各组分均达到基线分离. 由表S1可知, 影响EGC/C分离度的主要因素为缓冲液的pH, 当pH=7.00时分离度最好; 影响C/EC分离度的主要因素也为缓冲液的pH, 当pH=6.80时分离度最好; 影响EGCG/ECG分离度的主要因素为SDS浓度, 当SDS浓度为30 mmol/L时分离度最好; 而影响ECG/DMY分离度的主要是乙腈比例, 当乙腈体积分数为5%时分离度最好. 由表S1还可知, EGC/C和C/EC这2对组分的分离度较小, 而EGCG/ECG和ECG/DMY这2对组分的分离度相对更好, 因此优先考虑各因素对分离度较小的EGC/C和C/EC的影响, 以各组分均能达到基线分离(分离度≥1.50)为前提对各因素进行优选, 通过SPSS 17.0软件分析, 最终确定优化的实验条件为A2B3C2D2, 即缓冲液由25 mmol/L硼砂、 35 mmol/L SDS和7%乙腈组成, pH=7.00. 在优化条件下对7种目标组分进行电泳分析, 结果如图2所示, 可见各组分均达到基线分离.

2.2 定量分析波长的选择

对目标分析物于设定的电泳条件下分别单标进样分析, 用PAD检测器在190～400 nm波长范围内全扫描. 根据各化合物的紫外吸收光谱得到儿茶素类5种化合物的最大吸收波长均为210 nm, 次吸收波长为280 nm, 由于EGC在280 nm处紫外吸收非常低, 故儿茶素类5种物质选择210 nm为定量分析波长; 二氢杨梅素的最大吸收波长为210 nm, 次吸收波长290 nm, 选择210 nm为其定量分析波长; 选择甘草酸的最佳吸收波长254 nm为其定量分析波长.

2.3 样品超声提取条件优化

超声波辅助提取法是利用超声波具有的机械效应、 空化效应及热效应来强化提取效果的方法[17]. 该方法具有提取效率高、 提取时间短、 操作简单和适应性广等优点, 可有效避免高温高压对待测组分的破坏, 在天然产物有效成分的提取中应用较为广泛[18]. 影响超声提取效能的因素有提取剂种类、 提取时间、 提取温度、 样品颗粒粒径和固液比等. 由于待测组分中的儿茶素类和二氢杨梅素对热不稳定[19,20], 所以实验选择常温下进行提取. 在预实验的基础上选取对提取效率影响较大的因素----提取剂甲醇浓度(A, 70%, 80%和90%, 体积分数), 超声时间(B, 10, 20和30 min), 固液比(C, g/mL: 1∶15, 1∶20和1∶25)以及提取次数(D, 1, 2和3), 采用L9(34)正交设计法对主要因素进行优化.

将1#～4#固态样品粉碎, 过100目筛, 混匀后备用. 取混合样27份, 各约1.0 g, 按正交设计方案分别进行处理, 每种组合测定3个平行样, 计算7种组分总含量的平均值, 采用SPSS 17.0软件进行统计分析. 结果(表S2, 见本文支持信息)表明, 各因素对提取效率的影响程度顺序为甲醇浓度>提取时间>固液比>提取次数, 其中提取剂甲醇浓度和提取时间为主要影响因素, 固液比和提取次数对提取效率无明显影响. 当提取时间从10 min提高到20 min时, 提取效率有较大提高; 而20 min到30 min提取效率改变较小. 为缩短实验周期, 选择超声提取时间为30 min, 不再增加提取时间; 同时由于提取次数对提取效率影响很小, 为减化提取过程, 实验选择只进行一次超声提取. 因此, 最终选择各因素最佳组合为A2B3C3D1, 即采用25 mL 80%的甲醇作为提取剂进行一次提取, 提取时间为30 min. 在最终优化的提取条件下对相同样品进行提取, 各组分总的含量为2.237 mg/g.

2.4 毛细管电泳分离

在优化的毛细管电泳分离条件和超声提取条件下, 标准溶液及样品的电泳谱图见图2. 标准中各组分均达到基线分离且出峰时间均在8 min内, 样品的测定采样电泳迁移时间和光谱匹配度进行定性, 峰面积进行定量.

2.5 方法学指标

2.5.1 回归方程、 线性范围和检出限 取系列混合标准溶液分别进样分析, 每个浓度重复测定3次, 以待测物浓度(x, μg/mL)为横坐标, 峰面积平均值(y, mAU5min)为纵坐标绘制标准曲线. 测定结果见表1, 各标准曲线的相关系数均在0.9989～0.9995之间. 以3倍和10倍基线噪声所对应的各组分含量计算出方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.26～2.22 μg/g和0.87～7.39 μg/g.

Table 1 Regression equation, linear range, LOD and LOQ of 7 components

2.5.2 精密度 取7种组分的混合标准溶液(C, EC, ECG, EGC, EGCG和DMY浓度为10 μg/mL, GA浓度为40 μg/mL)进行测定, 在同一天内连续进样6次, 以峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)考察日内精密度; 对同一混合标准溶液连续6 d进样测定, 考察日间精密度. 结果(表2)显示, 日内精密度和日间精密度分别为1.3%～2.5%和1.9%～3.9%, 满足分析方法对精密度的要求.

Table 2 Intra-day precision and inter-day precision(n=6)

2.5.3 加标回收率 将同一样品分别加入3个不同浓度水平的标准溶液中, 每个浓度水平测定6个平行样, 结果见表3. 回收率在91.4%～104.9%之间, 加标样品的RSD在1.4%～3.2%之间, 表明该方法能满足实际分析测定准确度的要求.

2.6 样品检测

称取1 g固态样品(精确至0.1 mg), 吸取1.00 mL液态样品并称重, 每份样品测定3个平行样,

Table 3 Results of the spiked recovery tests*(n=6)

对样品进行前处理后进样, 测得样品中各待测物的含量列于表4. 结果表明, 样品中均含有多种功效成分. 所检出的功效成分中儿茶素类的检出频率较高, 这可能与其在植物中广泛存在有关. 虽然藤茶作为醒酒护肝产品应用的时间较短, 但二氢杨梅素在藤茶中的含量较高(表4, Sample 1), 研究[21]表明二氢杨梅素能有效清除自由基, 具有较强的抗氧化活性, 是护肝醒酒的良品, 说明藤茶可能具有较好的醒酒护肝功效, 具有一定的应用前景.

Table 4 Contents of the target components in 8 samples*(mg/g, n=3)

综上所述, 建立了用毛细管电泳同时测定醒酒护肝产品中多种功效成分的方法, 并通过正交设计对实验条件进行了优化, 该方法能在8 min内实现7种功效成分的基线分离. 与传统的高效液相色谱法相比, 本文方法具有样品需用量少、 分析时间短、 特异性好、 环境污染小、 灵敏度高且重现性好等优点, 可用于批量样品的检测, 能满足市售保健品中多种醒酒护肝功效成分的常规分析和质量评价.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150980.

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(Ed.: D, K)

Simultaneous Determination of 7 Components in Functional Food for Anti-hangover and Hepatoprotection by Capillary Electrophoresis†

† Supported by the 12th Five-year National Key Technology R & D Program, Ministry of Science and Technology of China(No.2012BAD33B02).

ZOU Haimin1,2, ZHOU Chen1, SUN Chengjun1, LI Yongxin1,YANG Xiaosong2, WEN Jun2, ZENG Hongyan1*

(1.WestChinaSchoolofPublicHealth,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;2.ChengduCenterforDiseaseControl&Prevention,Chengdu610047,China)

A rapid method of micellar electrokinetic capillary electrophoresis(CE) coupled with diode array detection was developed for simultaneous determination of catechin, epicatechin, epigallocatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, dihydromyricetin and glycyrrhizic acid in functional food for anti-hangover and hepatoprotection. The parameters of capillary electrophoresis, including buffer concentration, concentration of sodium dodecyl sulfate(SDS), volume ratio of acetonitrile, and pH of the buffer, were optimized with orthogonal design. Under the optimal analytical conditions, the peak area of each analyte and its concentration had a good correlation within the linear range(r≥0.9989). Limit of detection(LOD) and quantification(LOQ) of the method were in the range of 0.26—2.22 μg/g(S/N=3) and 0.87—7.39 μg/g(S/N=10), respectively. The intra- and inter-day relative standard deviations(RSDs) of the mixed standard solution were 1.3%—2.5% and 1.9%—3.9%, respectively. While the spiked recoveries of the analytes were 91.4%—104.9% and the RSDs of the spiked samples were 1.4%—3.2%. The method of capillary electrophoresis for determination of the 7 components in functional food for anti-hangover and hepatoprotection was proposed in this study and could achieve baseline separation for all the target components within 8 min. The results show that the method could meet the requirement for routine analysis and quality control and evaluation.

Micellar electrokinetic capillary electrophoresis; Orthogonal design; Catechin; Dihydromyricetin; Glycyrrhizic acid

2015-12-23.

日期: 2016-06-02.

科技部“十二五”科技支撑计划(批准号: 2012BAD33B02)资助.

10.7503/cjcu20150980

O657.8

A

联系人简介: 曾红燕, 女, 博士, 副教授, 主要从事理化检验方法研究. E-mail: zhm504532@163.com