miR-128抑制结肠癌侵袭转移的机制研究

曹跃鹏 庞洪双 陈成 袁旦平

miR-128抑制结肠癌侵袭转移的机制研究

曹跃鹏 庞洪双 陈成 袁旦平

目的 分析miR-128在结肠癌细胞中的表达情况，研究其对结肠癌细胞生物学行为的影响及作用机制。方法 对转染miR-128模拟物后的结肠癌SW48细胞进行培养，采用MTT法行细胞增殖实验检测细胞增殖能力，细胞划痕法检测细胞迁移能力，Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力；并采用RT-RCR检测miR-128 mRNA的表达，Western blot法检测miR-128蛋白的表达。结果 转染miR-128模拟物后的结肠癌SW48细胞较转染空白对照模拟物后的，细胞增殖、侵袭及迁移能力均下降（均P＜0.05），且转录因子Sp1基因在mRNA及蛋白水平均下降（均P＜0.05）。结论 miR-128可抑制结肠癌细胞增殖及侵袭转移，可能通过调控Sp1基因发挥上述作用。

miR-128 结肠癌 侵袭转移 增殖

结肠癌是全球发病率及病死率较高的恶性肿瘤[1]，主要行手术治疗、化疗及放疗。结肠癌侵袭转移是疾病治疗失败的主要原因。其侵袭转移的机制包括上皮间质转化、细胞外基质降解、血管生成及微环境改变等[2]。癌基因及抑癌基因的转录调控失衡是结肠癌侵袭转移的另一重要原因。miRNA是长度约为19～24个碱基的非编码RNA，主要通过结合靶基因mRNA的3′端非编码区，降解mRNA或抑制其翻译，调控靶基因的表达，进而影响细胞增殖、转移等[3]。已有研究表明，miR-128对前列腺癌及脑胶质瘤的侵袭转移有明显的抑制作用[4-5]。本研究通过分析miR-128在结肠癌细胞中的表达情况及对其生物学功能的影响，探讨miR-128与结肠癌增殖及侵袭转移的关系，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人结肠癌SW48细胞由宁波市第一医院中心实验室保存。DMEM高糖培养基和FBS为美国Gibco公司产品，Sp1及GAPDH抗体为Santa Cruz公司产品，Matrigel胶为美国BD公司产品，Lipofectamin 2000为美国Invitrogen公司产品，MTT试剂为上海碧云天生物公司产品，Transwell小室为美国康宁公司产品，Trizol试剂盒为上海英俊公司产品，RT-PCR逆转录试剂盒为美国Fermentas公司产品。miR-128模拟物及空白对照模拟物为广州锐博公司产品。GAPDH、Sp1、U6、miR-128引物为上海英俊公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将结肠癌SW48细胞传代至6孔板、24孔板或96孔板，待细胞融合度达50%～80%时使用miR-128模拟物及空白对照模拟物转染；培养6h后换液，48h后收集细胞进行以下实验。

1.2.2 细胞增殖实验 采用MTT法行细胞增殖实验。利用胰酶消化结肠癌SW48细胞，细胞计数，按1 000个细胞/孔浓度接种于96孔板中；每隔2 h，每孔加入20μl MTT试剂，37℃继续培养4h；酶标仪测定波长为490nm的吸光度值，分别记录0、24、48、72、96h的吸光度值，以吸光度值代表细胞增殖能力，重复实验3次。

1.2.3 细胞迁移实验 使用细胞划痕法检测细胞迁移能力。将结肠癌SW48细胞接种于6孔板，至生长至100%融合度；使用无菌10μl枪头在细胞板上划痕，洗涤细胞；加入5%血清的培养基培养，24h后观察细胞的变化并摄像；分别测量转染miR-128模拟物及转染空白对照的细胞任意3个部位的不同宽度，计算伤口愈合率，取平均值代表细胞迁移能力，重复实验3次。

1.2.4 细胞侵袭实验 采用Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力。取25μl 50%的Matrigel胶加入Transwell小室中，在37℃培养箱中孵育2h；用胰酶消化贴壁结肠癌SW48细胞，稀释至2.5×105个/ml；吸取200μl细胞悬液和800μl含20%血清的培养基加入Transwell板的上室中，放回细胞培养箱；培养48h后，应用1%的甲醛固定后使用0.1%结晶紫染色，于显微镜下选取3个视野观察并计数，取平均值代表细胞侵袭能力，重复实验3次。

1.2.5 RT-PCR检测miR-128 mRNA的表达 按照Trizol试剂盒使用说明书从结肠癌SW48细胞中提取RNA；按照RT-PCR逆转录试剂盒说明书将mRNA反转录为cDNA，使用GAPDH、Sp1、U6、miR-128引物进行RT-PCR扩增，引物序列见表1；以GAPDH或U6基因表达为内参，以Ct值代表结肠癌SW48细胞中miR-128及Sp1基因mRNA的表达水平，重复实验3次。

表1 GAPDH、Sp1、U6、miR-128引物序列

1.2.6 Western blot法检测miR-128蛋白的表达 使用NP40裂解液提取结肠癌SW48细胞的总蛋白，上样量为50μg；采用SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1h；分别用GAPDH、Sp1抗体4℃孵育过夜，次日孵育对应的二抗，室温孵育1h，使用Tris-HCl缓冲盐溶液洗涤后ECL化学显色；重复实验3次。

1.2.7 miR-128靶基因预测 采用生物信息学的方法，应用Traget Scan等数据库对miR-128靶基因进行预测；进而用RT-PCR及Western Blot法检测miR-128对靶基因表达的影响，以验证靶基因。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 转染miR-128模拟物后结肠癌SW48细胞增殖实验吸光度值的变化 见表2。

表2 转染miR-128模拟物后结肠癌SW48细胞增殖实验吸光度值的变化

由表2可见，转染miR-128模拟物后的结肠癌SW48细胞较转染空白对照模拟物的，增殖能力下降（P＜0.05）。

2.2 转染miR-128模拟物后结肠癌SW48细胞迁移实验伤口愈合率、侵袭实验视野细胞数的变化 见表3。

表3 转染miR-128模拟物后结肠癌SW48细胞迁移实验伤口愈合率、侵袭实验视野细胞数的变化

由表3可见，转染miR-128模拟物后的结肠癌SW48细胞较转染空白对照模拟物的，迁移、侵袭能力均下降（均P＜0.05）。

2.3 miR-128靶基因 miR-128可以影响转录因子Sp1基因的表达（图1a），转染miR-128模拟物后的结肠癌SW48细胞较转染空白对照模拟物的，Sp1基因在mRNA及蛋白水平均下降（图1b、c，均P＜0.05）。

图1 miR-128靶基因预测（a：可能靶基因Sp1；b：Western blot电泳图；c：PT-RCR结果）

3 讨论

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，且其发病率和病死率仍在不断上升，严重威胁人类健康。结肠癌发生侵袭转移是导致治疗效果不佳的重要原因。大多学者认为其侵袭转移是由多种癌基因及抑癌基因的表达异常导致的[6-7]。

多种肿瘤中miRNA存在异常表达。现已发现miR-128可通过抑制BMI-1基因表达来抑制前列腺癌的进展[5]。Donzelli等[8]发现miR-128通过靶向调控E2F5基因增强突变型p53的功能，从而影响肺癌的进展。本研究通过转染miR-128模拟物使得结肠癌细胞过表达miR-128，进而行结肠癌细胞生物学行为相关实验。结果发现，过表达miR-128的结肠癌细胞增殖能力降低。这说明miR-128可抑制结肠癌细胞的增殖。此外，本研究还发现miR-128能明显抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭能力。由此可知，miR-128在结肠癌侵袭转移中发挥重要作用。

目前，miRNA的研究多采用生物信息学的方法来预测下游可能的靶基因[9]。本研究通过Target Scan网站筛选了miR-128可能的靶基因。通过RT-PCR及Western blot法发现，当miR-128过表达后，转录因子Sp1基因在mRNA及蛋白水平均下降。Sp1蛋白属于Sp/类Krǜppel转录因子家族，已有研究表明，Sp1可以通过调控癌基因、抑癌基因、细胞周期调控分子以及生长相关信号转导通路，对各型肿瘤细胞产生重要影响[10]。

综上所述，miR-128可通过抑制结肠癌细胞的增殖，进而抑制其侵袭转移的能力，其可能是通过抑制Sp1基因的表达来发挥作用。

[1] Hansen TF,Sorensen F B,Lindebjerg J,et al.The predictive value ofmicroRNA-126 in relation to firstline treatmentwith capecitabine and oxaliplatin in patients with metastatic colorectal cancer[J].BMC cancer,2012,12(1):83.

[2] GulhatiP,Bowen KA,Liu J,et al.mTORC1 and mTORC2 regulate EMT,motility,and metastasis of colorectal cancer via RhoA and Rac1 signaling pathways[J].Cancer research,2011,71(9):3246-3256.

[3] Shang J,Fu Y,Wang Y,et al.MicroRNA-23a Antisense Enhances 5-Fluorouracil Chemosensitivity Through APAF-1/Caspase-9 Apoptotic Pathway in ColorectalCancer Cells[J].Journalof Cellular Biochemistry,2014,115(4):772-784.

[4] Dong Q,CaiN,Tao T,et al.An Axis Involving SNAI1,microRNA-128 and SP1 Modulates Glioma Progression[J].PloS one,2014, 9(6):e98651.

[5] Min J,Tao Z,Can L,et al.miRNA-128 suppresses prostate cancer by inhibiting BMI-1 to inhibit tumor-initiating cells[J].Cancer Research,2014,74(15):4183-4195.

[6] 陈建武,王佩飞,郑佩赞,等.结肠癌中COX-2表达及其与肿瘤脉管生成的关系[J].浙江医学,2012,34(20):1644-1646.

[7] 余红敏,陈积贤,任约翰,等.miR-142-3p在结直肠癌中的表达及其临床意义[J].浙江医学,2013,35(17):1565-1567.

[8] Donzelli S,Fontemaggi G,Fazi F,et al.MicroRNA-128-2 targets the transcriptional repressor E2F5 enhancing mutant p53 gain of function[J].CellDeath&Differentiation,2011,19(6):1038-1048.

[9] 李楠.miR-126靶向调控IRS1,SLC7A5及TOM1基因抑制结肠癌的增殖及侵袭转移[J].中南大学学报(医学版),2013,38(8):809-817.

[10] Ivanovska I,BallAS,Diaz R L,et al.MicroRNAs in the miR-106b family regulate p21/CDKN1A and promote cell cycle progression[J].Molecular and cellular biology,2008,28(7):2167-2174.

MicroRNA-128 inhibits invasion of colon cancer cells

CAO Yuepeng，PANG Hongshuang，CHEN Cheng,et al.Department of Anorectal Surgery，Ningbo First Hospital,Ningbo 315010,China

Objective To investigate the expression of microRNA-128(miR-128)in colon cancer cells and its effect on invasion and metastasis of cancer cells. Methods Human colon cancer SW48 cells were transfected with miR-128 mimics.The cell proliferation was determined by MTT assay,cell migration and invasion were detected by scratch and Transwell methods,the target genes of miR-128 were identified by Western Blot and qPCR methods. Results The proliferation,invasion and migration in miR-128-transfected SW48 cells(P＜0.05).The expression of Sp1 mRNA and protein level were decreased in miR-128 over-expressing SW48 cells(P＜0.05). Conclusion MicroRNA-128 can inhibit the proliferation and invasion of colon cancer,in which Sp1 gene may be involved.

miR-128 Colon cancerMetastasis Proliferation

2014-09-09）

（本文编辑：李媚）

宁波市科技计划项目（201501HJ-B01430）

315000 宁波市第一医院肛肠外科（曹跃鹏、庞红双、袁旦平）；山东大学齐鲁医院普外科（陈成）

袁旦平，E-mail：yuandanping1964@163.com