黄芪药渣发酵液中乙醇含量测定方法的研究

方尔博，吴嘉荣，黎权辉，张英

（广州中医药大学中药学院，广东广州510006）

·中药质量与控制·

黄芪药渣发酵液中乙醇含量测定方法的研究

方尔博，吴嘉荣，黎权辉，张英

（广州中医药大学中药学院，广东广州510006）

【目的】建立黄芪药渣发酵液中乙醇含量的测定方法。【方法】采用顶空气相色谱法，以正丙醇为内标物，采用安捷伦HP-5色谱柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），程序升温（起始温度40℃，保留6 min；以3℃·min-1的升温速率升至55℃，保留2 min；再以7℃·min-1的升温速率升至120℃，保留2 min）；进样口温度180℃；FDI检测温度为200℃；载气为氮气，流速1 mL·min-1。【结果】黄芪药渣发酵液中乙醇得到有效分离，乙醇在所考察的浓度范围内线性关系良好（r=0.999 1），平均回收率为98.12%。【结论】顶空气相色谱法可用于黄芪药渣发酵液中乙醇含量的测定；该方法操作简便，准确度和灵敏度高。

黄芪/生产与制备；药渣/分析；乙醇/分析；色谱法，顶空气相

顶空气相色谱法（head-spacegaschromatography，HS-GC）又称液上气相色谱分析，近年来作为一种样品前处理方式与气相色谱联用的操作技术得以迅速发展，用于分析聚合材料中的残留溶剂或单体[1-5]，并在检测血液中乙醇含量[6-8]，废气[9]、废水[10-13]中易挥发性有害物质，以及药物中残留易挥发性成分[14-19]等方面日益成熟，但用于中药药渣发酵液中易挥发性成分的检测却鲜见报道。因此，本实验利用顶空气相色谱法，在前期研究的基础上对色谱条件进行了改进，以期建立黄芪药渣发酵液中乙醇含量的测定方法，为优化药渣发酵工艺路线及后期发酵动力学研究提供参考，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器黄芪药渣发酵液为广州中医药大学中药学院实验室自制。正丙醇（色谱纯，上海晶纯生化科技股份有限公司，批号：G1522020）；乙醇（色谱纯，上海展云化工有限公司，批号：150302）；水为超纯水。2010plus气相色谱仪（日本岛津公司）；HSS 86.50顶空进样器（意大利丹尼公司）。

1.2 对照品溶液和供试品溶液的配制

1.2.1 对照品溶液配制分别精密量取乙醇12.5、25、50、100、200、400 μL置于25 mL量瓶中，分别精密加入正丙醇25 μL，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10 mL置于20 mL顶空进样瓶中，加盖，密封，即得。

1.2.2 供试品溶液配制精密量取正丙醇25 μL置于25 mL量瓶中，用黄芪药渣发酵液稀释至刻度，摇匀，精密量取10 mL置于20 mL顶空进样瓶中，加盖，密封，即得。

1.3 色谱条件的优化

1.3.1 条件1参考陈文丽等[20]实验色谱条件，柱温起始温度40℃，保留2 min，以7℃·min-1的速率升温至120℃，保留2 min；载气为氮气，流速为1 mL·min-1；进样口温度为180℃；检测器温度为200℃；分流比为5∶1[20]。按照此条件（条件1）进样分析得到的结果见图1。由图1可以看出，内标物正丙醇的出峰时间为6.190 min，与乙醇峰已经分离。但乙醇峰前后各有一个小峰并未完全分离，且作为内标物的正丙醇与乙醇的出峰时间较为接近。

图1 条件1色谱图Figure 1Chromatogram under condition 1

1.3.2 条件2在条件1中，乙醇出峰时间约为5 min，温度约为60℃。对条件1进行优化，使接近乙醇出峰时间的温度保持不变，程序升温速率为7℃·min-1，升至55℃，保留2 min，再升温至120℃（条件2）。条件2具体为：柱温起始温度40℃，保留2 min，以7℃·min-1的速率升温至55℃，保留2 min，再以7℃·min-1升温至120℃，保留2 min；其他条件保持不变。试验得到的结果见图2。由图2可以看出，乙醇峰前的杂质峰与乙醇峰的分离程度与条件1比较并无显著改善。

图2 条件2色谱图Figure 2Chromatogram under condition 2

1.3.3 条件3在条件2的基础上，发现仅仅使乙醇出峰时间的温度保持不变，效果并不理想，考虑降低乙醇出峰前的升温速率，改为3℃·min-1（条件3）。条件3具体为：柱温起始温度为40℃，保留2 min，以3℃·min-1升温至55℃，保留2 min，再以7℃·min-1升温至120℃，保留2 min；其他条件保持不变。试验得到的结果如图4所示。由图4可以看出，乙醇峰与前后2个杂质峰的分离程度较条件2有明显的改善。

图3 条件3色谱图Figure 3Chromatogram under condition 3

1.3.4 条件4为了进一步将乙醇峰与杂质峰进行分离，考虑到再次降低升温速率效果不显著，因此在条件3的基础上，将柱温起始温度的保留时间延长至乙醇出峰（条件4）。条件4具体为：柱温起始温度为40℃，保留6 min，以3℃·min-1升温至55℃，保留2 min，再以7℃·min-1升温至120℃，保留2 min；其他条件保持不变。试验结果如图5所示。由图5可以看出，乙醇峰前的杂质峰、乙醇峰和乙醇峰后的杂质峰出峰时间为5.00、5.30、5.56 min。由于乙醇峰前的杂质峰出峰时间为5 min，在柱温起始温度的保留时间内，所以无论再降低升温速率还是延长起始温度保留时间，乙醇峰前杂质峰的出峰时间将不改变。而乙醇峰与前后的杂质峰已经分离，故将条件4作为本实验的最优条件，并进行方法学考察。

图4 条件4色谱图Figure 4Chromatogram under condition 4

1.4 色谱条件进样口温度：180℃；检测器温度：200℃；柱温：起始温度为40℃，保留6 min，以3℃·min-1的升温速率升至55℃，保留2 min，再以7℃·min-1的升温速率升至120℃，保留2 min。载气为氮气，流速1 mL·min-1；分流比5∶1。顶空进样器参数：平衡温度85℃，定量环温度100℃，转移管温度105℃，平衡时间30 min。

1.5 标准曲线的绘制取按1.2.1项制备的对照品溶液，按1.4项色谱条件进行测定。记录各峰面积。以对照品中乙醇的质量浓度为横坐标（X），乙醇峰面积/正丙醇峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得乙醇浓度的线性回归方程。

1.6 方法学考察

1.6.1 专属性试验分别精密量取空白溶液、对照品溶液与供试品溶液各10 mL，置于20 mL进样瓶中，加盖，密封，按1.4项色谱条件进行测定，记录色谱图，考察方法的专属性。

1.6.2 精密度试验取同一份供试品溶液，按1.4项色谱条件，连续进样6次，以峰面积比计算sR，考察方法的精密度。

1.6.3 重复性试验取6份发酵液，按1.2.2项方法，平行制备6份供试品溶液。分别精密移取10 mL，置于20 mL进样瓶中，加盖，密封。按1.4项色谱条件进行测定，记录峰面积。将测定结果换算成样品中乙醇的含量，并求出6个乙醇含量的sR及平均含量，考察方法的重复性。

1.6.4 稳定性试验精密量取正丙醇100 μL，置于100 mL量瓶中，用黄芪药渣发酵液稀释至刻度，摇匀，分别精密量取10 mL置5个20 mL顶空进样瓶中，加盖，密封。在制备后的0、2、4、8、12 h，按1.4项色谱条件测定，以峰面积比计算sR，考察方法的稳定性。

1.6.5 加样回收率试验精密量取黄芪药渣发酵液5 mL 6份，分别置于6个顶空进样瓶中，加入5 mL已知浓度的对照品溶液，加盖，密封，摇匀。按1.4项色谱条件进行测定，计算回收率。

2 结果

2.1 标准曲线的建立以对照品中乙醇的质量浓度为横坐标（X），乙醇峰面积/正丙醇峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y=0.538X+ 0.041，r=0.999 1，线性范围为0.395～6.312 mg/mL。

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性实验图5结果显示：乙醇峰的保留时间为5.301 min，正丙醇峰的保留时间为6.329 min。待测组分可得到有效的分离，无干扰成分，本方法专属性良好。

图5 专属性考察结果Figure 5Results of specificity test

2.2.2精密度和稳定性试验以峰面积比计算sR，精密度的sR为2.07%（n=6）（见表1），表明仪器的精密度良好。稳定性的sR为0.72%（n= 6）（见表2），表明待测成分在供试品溶液中12 h内稳定。

2.2.3 重复性和回收率试验重复性试验结果如表3所示：乙醇平均含量为2.34 mg/mL，sR= 2.42%（n=6）。加样回收率试验结果如表4所示：回收率分别为102.0%、95.2%、97.1%、102.2%、95.0%、97.3%，均在95%～105%之间，sR= 3.27%（n=6）。表明该方法的重复性和回收率良好。

表1 精密度试验结果Table 1Results of precision experiment

表2 稳定性试验结果Table 2Results of stability experiment

表3 重复性试验结果Table 3Results of repetition experiment

表4 回收率试验结果Table 4Results of recovery ratio

3 讨论

数据显示，目前我国中药材种植面积为240余万公顷，药材年产量约7 000万吨[21]。而在中药资源进行深加工产业化的过程中，所产生的药渣等固体废弃物有3 500万吨之巨[21]。如何处理数量庞大的中药药渣是一项新课题[21]。对中药药渣的处理，通过微生物发酵药渣产生乙醇，来实现废物利用不失为一项有效措施，是符合绿色环保和清洁生产发展趋势的。而在后续发酵工艺的优化及过程动力学研究中，精确定量中药药渣发酵液中的乙醇含量尤为重要。

本研究在参考有关文献[1-20]的基础上，建立顶空气相色谱法测定中药黄芪药渣发酵液中乙醇的含量。结果显示：通过程序升温能够有效分离待测组分，且各组分间分离度良好；该方法稳定性和重现性亦良好。表明顶空气相色谱法可用于黄芪药渣发酵液中乙醇含量的测定。另外，本研究采用顶空进样，不仅避免了直接进样时发酵液对检测的干扰及对色谱柱的污染，又可通过前期富集提高待测组分检测的灵敏度。基于以上研究结果，该方法在中药黄芪药渣发酵液中乙醇含量测定中已成功建立，值得进一步推广和应用。

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【责任编辑：黄玲，侯丽颖】

Determination of Ethanol Content in Fermentation Broth of
Radix Astragali Residue

FANG Erbo，WU Jiarong，LI Quanhui，ZHANG Ying
（School ofChinese Herbal Medicine，Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo establish a method for determining the ethanol content in the fermentation broth of Radix Astragali residue.MethodsN-propyl alcohol was used as the internal standard.Head-space gas chromatography was performed on Agilent HP-5 chromatography column（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）. Programmed temperature started at 40℃maintaining for 6 min，rose up to 55℃at a rate of 3℃·min-1，maintaining for 2 min，and then heated up to 120℃at a rate of 3℃·min-1maintaining for 2 min.Injection entrance temperature was 180℃.The FDI detector temperature was 200℃.Nitrogen was used as the carrier gas，and the flow rate was 1 mL·min-1.ResultsAnalytes were separated effectively.Ethanol had good linear relationship within the range examined（r=0.999 1），and the mean recovery was 98.12%.ConclusionThe method can be usedto determine the ethnol content in the fermentation broth of Radix Astragali residue，and it has the advantages of easy operation，high precision and high sensitivity.

Radix Astragali/production&preparation；residue/analysis；ethanol/analysis；chromatography，head-space gas

R284.1

A

1007-3213（2016）06-0856-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.023

2016-06-20

方尔博（1993-），男，本科；E-mail：1262405803@qq.com

张英（1976-），女，博士研究生，副教授；E-mail：tjxyzy@gzucm.edu.cn

国家自然科学基金资助项目（编号：8140140277）；广州中医药大学“青年英才培养工程”资助（编号：QNYC20140112）