白簕粗多糖的脱色纯化及其产物降糖活性研究

何冠成，张旭红，周露，程轩轩，潘育方，杨慧文

（广东药科大学药学院，广东广州510006）

白簕粗多糖的脱色纯化及其产物降糖活性研究

何冠成，张旭红，周露，程轩轩，潘育方，杨慧文

（广东药科大学药学院，广东广州510006）

【目的】探讨白簕粗多糖的最优脱色工艺条件参数，并考察脱色后多糖的降糖活性。【方法】以多糖保留率、脱色率为指标，比较AB-8、D-101、DM-301、HPD-600型大孔树脂和聚酰胺树脂的脱色效果，通过单因素考察与正交实验优化静态吸附脱色条件；并通过链脲霉素（STZ）诱导糖尿病小鼠模型考察脱色后多糖的降糖药理活性。【结果】HPD-600大孔树脂的脱色效果最好，其最佳脱色条件为：多糖溶液pH=4.0，液固比为30∶1（mL/g），20℃时慢速振摇吸附4 h。最佳条件下，粗多糖的脱色率为（80.09±1.06）%，多糖保留率为（87.90±2.04）%。降糖药理实验结果表明，脱色后白簕多糖对STZ诱导的糖尿病小鼠具有降血糖作用，多糖高剂量组小鼠的血糖抑制率达43.04%。【结论】该脱色工艺稳定可靠，适用于白簕粗多糖的脱色纯化，且脱色后多糖有一定的降血糖功效。

白簕/生产和工艺；粗多糖/分析；大孔树脂；脱色；糖尿病/中药疗法；疾病模型，动物；小鼠

白簕Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.，又称三加皮、刺三加，为五加科植物，广泛分布于长江以南地区，广东地区资源丰富。白簕味苦而甘辛凉，作为民间草药和野蔬有着悠久的历史，具有清热解毒、祛风利湿、舒筋活血、止咳平喘之功效[1]。白簕的化学成分有黄酮、三萜皂苷、色素、多糖等，近年来关于白簕中皂苷、黄酮、色素的提取和理化性质研究常有报道[2-7]，但鲜有关于多糖的纯化及药理鉴定研究的报道。研究显示，植物多糖具有抗肿瘤、增强免疫、抗衰老、抗病毒等作用[8]，而白簕中含有丰富的多糖。本实验室的前期研究已发现白簕粗多糖具有抗炎镇痛[9]、抗疲劳[9]、降血糖[10]功效，若要得到作用效果更明确的多糖，尚须进行粗多糖深加工。粗多糖含有色素，颜色较深，脱色是多糖提取纯化过程中一个十分重要的环节[11]。本课题组就本实验室制备的棕褐色固体粗多糖进行脱色研究，探讨其最优脱色工艺条件参数，并考察脱色后多糖的降糖活性，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验药物与试剂白簕茎经广东药科大学中药学院刘基柱副教授鉴定为五加属植物白簕Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.的茎，标本保存于广东药科大学中药学院标本室及恩平响山簕菜茶厂；AB-8、D-101、DM-301、HPD-600型大孔树脂，聚酰胺树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；生理盐水（500 mL，广东艾希德药业有限公司，批号：H15010106）；链脲佐菌素（STZ，上海晶纯生化科技股份有限公司，批号45543）；二甲双胍（石家庄市普力制药有限公司，批号：1404031004）；柠檬酸、柠檬酸三钠为分析纯，购自天津福晨化学试剂厂；苯酚、体积分数为95%的乙醇、双氧水、硫酸、盐酸（HCl）及氢氧化钠（NaOH）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器FA1004型电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）；KQ5200型超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限责任公司）；XW-80A型微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；HY-2型调速多用振荡器（常州金坛金城教学仪器厂）；HH-2型数显恒温水浴锅（常州市澳华仪器有限公司）；LD4-2A型台式离心机（北京京立离心机有限公司）；BGZ-30型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）；721型紫外分光光度计（上海精密仪器有限公司）；安稳型血糖仪（三诺生物传感技术有限公司）。

1.3 实验动物雄性KM小鼠60只，体质量（20±2）g，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（粤）2013-0020。

1.4 白簕粗多糖的制备白簕粗多糖按照文献[9]的方法进行制备富集。

1.5 树脂的预处理及再生预处理：AB-8、D-101、DM-301及HPD-600型大孔树脂，聚酰胺树脂→体积分数为95%的乙醇浸泡过夜→去离子水清洗至无醇味。再生：树脂→50 g/L NaOH浸泡搅拌4 h→大量清水冲洗至接近中性→50 g/L HCl浸泡搅拌4 h→大量清水冲洗至接近中性→体积分数为95%的乙醇浸泡12 h→大量清水冲洗至无醇味。

1.6 白簕粗多糖脱色工艺优化

1.6.1 多糖保留率的测定按照苯酚—硫酸法[12]测定脱色前后的白簕多糖溶液多糖含量，按照以下公式计算多糖保留率[12]：p多糖保留率（%）=m脱色后多糖含量÷m脱色前多糖含量×100%。

1.6.2 多糖脱色率的测定对脱色前后的多糖溶液进行200～800 nm范围的全波长扫描，结果表明溶液无最大吸收波长。参考文献[13]并利用互补色原理，确定以λ=450 nm为吸收波长，测定多糖溶液脱色前后的吸光度（D），并按照以下公式计算脱色率[12]：p脱色率（%）=（D脱色前-D脱色后）÷D脱色前× 100%。其中，D脱色前和D脱色后分别为脱色前后多糖溶液的吸光度。

1.6.3 树脂材料的筛选配制浓度为4 mg/mL的粗多糖溶液，量取该溶液35 mL和50 mL，加入4种型号大孔树脂和聚酰胺树脂各1 g，考察在2种不同溶液体积条件下不同树脂的脱色效果；在室温下振摇吸附10 h后取滤液，测定脱色率与多糖保留率，并根据这两个指标对不同树脂进行评价。

1.6.4 HPD-600大孔树脂脱色法单因素实验以脱色率和多糖保留率为指标，对HPD-600大孔树脂脱色法的各个影响因素进行考察，方法如下：

1.6.4.1 考察液固比（V∶m）对脱色效果的影响固定HPD-600树脂用量为1 g，分别加入20、30、40、50、60 mL浓度为4 mg/mL的粗多糖溶液，室温下振摇吸附10 h后，抽滤、取滤液，测定脱色率与多糖保留率，考察不同液固比对脱色效果的影响。

1.6.4.2 考察pH值对脱色效果的影响固定HPD-600树脂用量为1 g，加入4 mg/mL粗多糖溶液30 mL，分别调整溶液pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，室温下振摇吸附10 h后，抽滤、取滤液，测定脱色率与多糖保留率，考察不同pH值对脱色效果的影响。

1.6.4.3 考察温度对脱色效果的影响固定HPD-600树脂用量为1 g，加入4 mg/mL粗多糖溶液30 mL，将pH值调整至4.0，分别在20、30、40、50、60℃时振摇吸附10 h后，抽滤、取滤液，测定脱色率与多糖保留率，考察不同温度对脱色效果的影响。

1.6.4.4 考察吸附时间对脱色效果的影响固定HPD-600树脂用量为1 g，加入4 mg/mL的粗多糖溶液30 mL，将pH值调整至4.0，30℃时振摇吸附，分别于第30、60、90、120、180、240、270、300、330及360 min时取少许上清液，抽滤后测定滤液吸光度，计算其脱色率，每组平行测定3次，考察不同吸附时间对脱色效果的影响。

1.6.5 正交实验设计利用L9（34）正交设计表设计正交实验，以多糖保留率和脱色率作为指标，综合考察脱色时间、脱色温度、脱色pH值以及液固比等4个因素对脱色效果的影响。采用加权评分法[14]对两项指标进行综合评分，把各项数值与该列最大值相除，再乘以100%得到该项得分；确定两项指标的权重系数：色素脱除率（X）权重系数为0.6、多糖保留率（Y）权重系数为0.4，对色素脱除率、多糖保留率两项指标进行加权求和，综合评分Z=0.6X+0.4Y，评分高者为最优工艺。筛选最优工艺实验因素及水平设计见表1，并对最优工艺进行重复性考察。

表1 正交试验因素与水平表Table 1Factors and levels of orthogonal test

1.7 白簕多糖对糖尿病小鼠降血糖效果

按照最优脱色工艺制备多糖样品，考察脱色后多糖的降糖效果。

1.7.1 糖尿病小鼠模型50只（20±2）g健康昆明（KM）小鼠适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h，腹腔注射150 mg/kg STZ，72 h后测定造模小鼠空腹血糖，以血糖浓度高于11.1 mmol/L为标准，选取造模成功的小鼠进行降糖实验[15]。

1.7.2 实验分组将10只未造模的正常小鼠作为正常对照组；对已造模成功的高血糖小鼠进行随机分组：模型组、二甲双胍组、白簕多糖低剂量组及白簕多糖高剂量组，每组10只，用苦味酸进行编号标记。其中多糖低、高剂量组分别给予小鼠灌胃100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1脱色后多糖，二甲双胍组给予小鼠灌胃125 mg·kg-1·d-1二甲双胍，正常对照组及模型组灌胃等体积生理盐水，连续给药14 d。于灌胃最后1 d禁食12 h测定空腹血糖及体质量，分析脱色后的白簕多糖对STZ诱导糖尿病小鼠的降糖效果。

1.8 统计方法采用SPSS 17.0软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，实验结果以均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 树脂材料的筛选将4种大孔树脂和聚酰胺树脂材料按照1.6.3项方法进行白簕粗多糖溶液的脱色处理，计算脱色后的多糖保留率和脱色率。表2结果显示，在实验条件下，HPD-600大孔树脂与其他树脂材料比较具有较优的多糖保留率与脱色率。因此，我们选用HPD-600大孔树脂作为脱色剂进行脱色工艺的优化。

表2 不同大孔树脂脱色结果Table 2Comparison of decoloration results of various macroporous resinsp/%

2.2 单因素实验考察结果

2.2.1 不同液固比考察结果固定其他脱色条件，分别加入20、30、40、50、60 mL多糖溶液，测定计算多糖保留率和脱色率，结果见图1。由图中数据可知，随着液固比增加，脱色率持续下降，其主要原因可能是大孔树脂的吸附以物理吸附为主，存在吸附饱和的现象，而溶液用量越多，越易达到饱和，因此吸附脱色效果就越差；相反，多糖保留率随液固比增加而逐渐上升。综合考虑多糖保留率与脱色率，选择液固比为30∶1，该比例有利于后期浓缩。

图1 不同液固比对脱色效果的影响Figure 1 Effect of ratios of liquid to solid on decoloration results

2.2.2 脱色pH值考察结果固定其他脱色条件，将多糖溶液pH值分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，测定多糖保留率和脱色率，结果见图2。结果表明，随着pH值增大，多糖脱色率明显下降，多糖保留率开始略有上升，随后即下降，综合考虑选择pH=4.0最优。

2.2.3 脱色温度考察结果固定其他脱色条件，考察脱色温度分别为20、30、40、50、60℃时的多糖保留率与脱色率，结果见图3。图3表明，随着温度升高，脱色率有所下降，且温度在40℃以上时，脱色率下降明显，其原因可能为温度过高时，色素的吸附也加快，导致脱色率下降[16]。根据结果综合考虑，选择30℃为最优吸附温度。

图2 不同pH值对脱色效果的影响Figure 2Effect of pH values on decoloration results

图3 不同温度对脱色效果的影响Figure 3Effect of temperatures on decoloration results

图4 不同脱色时间对脱色效果的影响Figure 4Effect of decoloration time on decoloration results

2.2.4 脱色时间考察结果固定其他脱色条件，考察脱色时间分别为30、60、90、120、180、240、270、300、330及360 min的脱色率，结果见图4。图4表明，随着时间的延长，脱色率逐渐增加，当吸附时间达到300 min时，脱色率基本不变，吸附基本趋于稳定，达到饱和。为了节约成本和资源，最终选择5 h作为吸附时间。

2.3 正交实验按1.6.5正交实验方案进行实验，实验结果如表3、4所示。从表3的极差结果可得出各因素对实验结果影响的主次顺序：溶液pH值＞液固比＞反应温度＞反应时间；表4的方差分析结果显示，脱色溶液的pH值与液固比对实验结果有显著影响（P＜0.05），时间和温度影响则不显著（P＞0.05），从经济效益的角度出发，选择其最短时间和最低温度。因此，最优组合为A1B1C1D1，最优工艺即为：30 mL多糖溶液中加入1 g HPD-600大孔树脂，调整pH值为4.0，在20℃时振摇吸附4 h。

表3 L9（34）正交试验结果表Table 3L9（34）orthogonal test

表4 正交优化大孔树脂脱色效果工艺方差分析表Table 4Variation analysis for the decoloration results of various macroporous resins optimized by orthogonal test

2.4 工艺验证按照正交结果最优方案，称取HPD-600大孔树脂1 g，加入4 mg/mL多糖溶液30 mL，调整pH值为4.0，20℃吸附4 h后抽滤，收集滤液，测定脱色率和多糖保留率，做5次重复验证实验，结果脱色率为（80.09±1.06）%，多糖保留率为（87.90±2.04）%，实验结果稳定。

2.5 药理实验结果

2.5.1 小鼠一般状况与体质量造模成功的糖尿病小鼠有明显的“三多一少”症状，给药14 d后，二甲双胍组和白簕多糖各剂量组的“三多”症状均有所减轻。分别记录给药前后小鼠的体质量，进行比较分析，结果见图5。图5结果显示，与给药前比较，正常对照组小鼠体质量明显增加，模型组与各治疗组小鼠体质量基本维持不变（P＞0.05），表明在实验时间内治疗药物对体质量影响不大。

图5 各组小鼠体质量变化Figure 5Comparison of mice body mass in various groups

2.5.2 对小鼠血糖影响各组小鼠给药前后空腹血糖（FBG）测定结果见表5。表5结果显示：STZ造模后，小鼠血糖显著升高，实验期间模型组小鼠FBG稳定，证明该模型较为可靠。给药14 d后，各给药组小鼠FBG均显著降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。与给药前FBG比较，各剂量白簕多糖均可显著降低小鼠FBG（P＜0.05或P＜0.01）；给药14 d后，高剂量组的血糖抑制率达43.04%。

表5 各组小鼠血糖测定结果Table 5Comparison of mice blood glucose levels in various groups

3 讨论

多糖是一类重要的分子量较大的生物活性物质[17]，黏度较大且水溶性较小，纯化的天然多糖一般为白色，但由于多糖的来源不同以及提取方法的缺陷，再加上来源植物组织成分的复杂性，提取得到的往往是含有一些色素杂质的粗多糖，呈棕褐色，这对多糖的定性定量分析等均存在较大影响；另外，有些粗多糖的有色小分子物质可能会发生转化，对后续测定结果进一步产生影响。因此，本课题组着眼于大孔树脂法对白簕多糖中色素的脱除工艺研究，并优化该工艺条件。

目前，去除粗多糖中的色素主要采用大孔树脂吸附法、活性炭吸附法及双氧水氧化脱色等方法[18]。前期预实验比较了后2种脱色法，结果发现：采用活性炭法脱色存在活性炭粉难以除尽的问题，对实验结果影响较大；采用双氧水氧化法进行脱色，虽然脱色率较高，但是多糖保留率偏低，可能是由于双氧水有较强的氧化性，大量多糖被破坏所致，故本课题组未采用这两种常用的脱色法。我们对5种不同树脂材料的脱色效果进行考察，发现HPD-600大孔树脂脱色效果较好，该法脱色率高且多糖损失较少，是较理想的白簕多糖色素脱色方法。通过正交试验优化HPD-600大孔树脂静态脱色工艺，最佳工艺条件为30 mL多糖溶液中加入1 g HPD-600大孔树脂，调整pH值为4.0，在20℃振摇吸附4 h。并对该条件下脱色得到的白簕多糖进行了降糖活性研究。通过建立STZ诱导糖尿病小鼠模型，测定给药前后小鼠FBG的变化，结果显示与模型组比较，各白簕多糖剂量组小鼠FBG均明显降低，FBG抑制率达40%左右，提示脱色后白簕多糖具有较好的降糖活性。本研究已确定白簕粗多糖最优脱色工艺参数，并验证了脱色后多糖的降糖活性。在本实验结果的基础上，今后可进一步开展对白簕多糖活性部位的探讨及其降糖作用机制的研究。

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【责任编辑：黄玲，侯丽颖】

Decoloration and Purification of Crude Polysaccharides from Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.and Hypoglycemic Activities of Its Products

HE Guancheng，ZHANG Xuhong，ZHOU Lu，CHENG Xuanxuan，PAN Yufang，YANG Huiwen
（School ofPharmacy，GuangdongPharmaceutical University，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the optimum decoloration technological conditions of crude polysaccharides from A canthopanan trifoliatus（L.）Merr.and hypoglycemic activities of its products.MethodsWith the decolorization rate and retention rate as indexes，we compared the decoloration results among AB-8，D-101，DM-301，HPD-600 macroporous resins and polyamide resin.And then we optimized the static absorption and decolorationprocedure by single-factor investigation and orthogonal test.In addition，we applied the streptozotocin-induced hyperglycemia mice to study the hypoglycemic activities of the decolored crude polysaccharides.ResultsHPD-600 macroporous resin was chosen as the optimal resin.The optimum decoloration technological conditions were as follows：Polysaccharide solution pH value was 4.0；Ratio of liquid to solid was 30∶1（mL/g）；Shaking slowly and adsorbing lasted for 4 hours at 20℃.Under the optimal conditions，decolorization rate and retention rate were（80.09±1.06）%and（87.90±2.04）%respectively.The results of the pharmacological experiment showed that decolorized polysaccharides from Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.were able to lower the blood glucose of hyperglycemia mice induced by streptozotocin.The blood glucose inhibition ratio reached to 43.04%in the group of high-dose polysaccharide.ConclusionThe bleaching process is stable and feasible，and can be used for the purification of crude polysaccharides from Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr..And the crude polysaccharides after decoloration can lower blood glucose in our experitment.

Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr./production＆preparation；crude polysaccharides/analysis；macroporous resin；decoloration；diabetes mellitus/TCD therapy；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）06-0840-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.020

2016-03-08

何冠成（1993-），男，本科生；E-mail：howardhe1017@163.com

杨慧文（1983-），女，高级实验师；E-mail：halley_yang@hotmail.com

广东省建设中医药强省科研课题（编号：20151267，粤中医[2015]11号）；广东药科大学大学生创新创业训练计划—创新训练项目（编号：201510573044）