石决牡蛎汤通过p38MAPK通路改善自发性高血压大鼠血管重构的机制研究

童晓云，周敏，余茂强，李晓，张俐，谢健

（1.云南中医学院第一附属医院，云南昆明650021；2.云南中医学院2014级研究生，云南昆明650500；3.浙江省丽水市第二人民医院，浙江丽水323000）

石决牡蛎汤通过p38MAPK通路改善自发性高血压大鼠血管重构的机制研究

童晓云1，周敏2，余茂强3，李晓1，张俐1，谢健1

（1.云南中医学院第一附属医院，云南昆明650021；2.云南中医学院2014级研究生，云南昆明650500；3.浙江省丽水市第二人民医院，浙江丽水323000）

【目的】探讨石决牡蛎汤通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路改善自发性高血压大鼠（SHR）血管重构的作用。【方法】将40只16周龄自发性高血压大鼠随机分为模型对照组，石决牡蛎汤高、中、低剂量组，卡托普利组，每组8只；将8只Wistar-Kyoto大鼠设为正常对照组。治疗8周后，采用苏木精—伊红（HE）染色法观察胸主动脉形态，光镜下采用计算机图像分析系统测量血管内膜中层厚度（IMT）、管腔直径（LD），酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中内皮素-1（ET-1）水平，硝酸还原酶法测定血清中一氧化氮（NO）水平，免疫组织化学法检测磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）在胸主动脉组织中的表达水平。【结果】与模型对照组比较，石决牡蛎汤中、高剂量组及卡托普利组收缩压和舒张压、ET-1水平均显著降低，NO水平增高，中药高剂量组及卡托普利组IMT、IMT/LD值显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学结果显示，石决牡蛎汤中、高剂量组及卡托普利组能较显著抑制p-p38MAPK在胸主动脉的表达。【结论】石决牡蛎汤可能通过抑制p38MAPK信号通路、调节ET/NO系统改善自发性高血压大鼠血管重构。

石决牡蛎汤/药理学；高血压/中药疗法；血管重构；p38MAPK通路；疾病模型，动物；大鼠

血管重构（vascular remodeling）是造成高血压靶器官损伤（target organs damage，TOD）的病理基础，逆转血管重构已成为防治高血压及其TOD的重要思路[1]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与细胞的发生、分化、增殖、凋亡密切相关[2]。p38MAPK作为MAPK家族的主要成员，在高血压血管重构中起重要作用[3]。石决牡蛎汤是全国名老中医邓铁涛教授治疗高血压病的经验方，前期临床研究[4-5]表明，石决牡蛎汤可有效降压，改善临床症状，延缓TOD。为进一步探讨石决牡蛎汤的降压机制，本研究应用石决牡蛎汤对实验性自发性高血压大鼠（SHR）模型进行干预，观察其对p38MAPK信号通路及血管重构的影响，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物自发性高血压大鼠，16周龄，40只，雌雄各半，体质量（200±50）g，SPF级；Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，16周龄，8只，雌雄各半，体质量（200±50）g，SPF级：均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK京2012-0001。

1.2 实验药物石决牡蛎汤由石决明30 g（先煎）、生牡蛎30 g（先煎）、牛膝15 g、钩藤15 g（后下）、白芍15 g、丹参15 g、莲子心10 g组成，所用中药均购自云南省中医医院中药房。将上述中药混合，制成水煎剂（含生药1 g/mL），灭菌备用。卡托普利片由开封制药（集团）有限公司提供，批号：H41022498，12.5 mg/片。

1.3 主要试剂与仪器兔抗大鼠磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；二步法免疫组织化学检测通用试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-6001）；内皮素-1（ET-1）测定试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；一氧化氮（NO）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。MD3000 ZH-HX-Z型无创尾动脉血压采集处理系统（安徽正华生物仪器设备有限公司）；RT-2100C酶标仪（上海光达电器厂）；752-P紫外分光光度计（上海现科仪器有限公司）；TGL-16c台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DM2500正置显微镜（德国Leica公司）。

1.4 分组及给药所有动物均在云南省中医医院实验中心动物饲养室分笼饲养，正式实验前每天测血压训练1次，连续7 d。适应性饲养1周后，将40只自发性高血压大鼠随机分为模型对照组，石决牡蛎汤高、中、低剂量组（以下简称中药高、中、低剂量组），卡托普利组，共5组，每组8只；将8只WKY大鼠设为正常对照组。根据成人日用药量，按动物系数折算，石决牡蛎汤大鼠的有效剂量为1.5 g·kg-1·d-1，以此为中剂量，3倍递增设置高剂量（4.5 g·kg-1·d-1），3倍递减设置低剂量（0.5 g·kg-1·d-1），分别给予灌胃治疗，每日1次；卡托普利组给予卡托普利片（30 mg·kg-1·d-1）灌胃治疗；模型对照组及正常对照组给予等体积的生理盐水灌胃。测量完当日血压后，每日上午定时灌胃给药。各组均自由饮水和普食饲养，共连续8周。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 血压血压测量方法为安静清醒状态下尾容积法。测压之前先把被测大鼠置于（40±1）℃恒温箱内预热5～10 min，使大鼠尾部血管充盈扩张以便测量。用无创尾动脉血压采集处理系统加压至搏动消失，放气后再次听到搏动声时血压计读数即为收缩压，搏动声消失时血压计读数为舒张压，重复测量4次，取平均值。用药前及用药后每周检测各组大鼠血压1次。

1.5.2 血管组织学与体视学观测末次用药后24 h，禁食不禁水12 h，用20 mg/L戊巴比妥钠按2 mg/kg体质量腹腔注射、麻醉，下腔静脉取血。分离、摘取胸主动脉，冲洗后以体积分数为10%的甲醛溶液固定，酒精梯度脱水，石蜡包埋，切片，行苏木精—伊红（HE）染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。切片染色后进行形态学观察（放大100倍）；光镜下采用计算机图像分析系统测量胸主动脉血管内中层膜厚度（IMT）、管腔直径（LD），并计算二者比值（IMT/LD）。

1.5.3 血清ET-1、NO检测采血后离心，收集血清。血清ET-1用酶联免疫吸附法（ELISA）进行测定，具体方法按照试剂盒说明书操作；血清NO采用硝酸还原酶法，具体方法按照试剂盒说明书操作。

1.5.4 免疫组织化学法检测p-p38MAPK在胸主动脉组织中的表达石蜡切片常规脱蜡水化，3%（体积分数）H2O2处理封闭内源性过氧化物酶，高压修复抗原，加封闭液后，滴加兔抗鼠p-p38MAPK多克隆抗体，浓度为1∶80，4℃过夜，次日加生物素羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，p-p38MAPK免疫组织化学染色可见阳性细胞胞浆染成棕黄色，高倍镜下（放大200倍）随机挑选5个视野，进行阳性细胞计数，再计算每视野平均阳性细胞数。

1.6 统计方法采用SPSS 19.0统计软件处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，同组不同时点的比较采用重复测量方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠收缩压的变化表1结果显示：治疗前，各造模组自发性高血压大鼠的收缩压比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。因16周龄自发性高血压大鼠血压仍处于自发性增高的阶段，故模型对照组的收缩压随鼠龄的增加呈现进行性增高；治疗第4周，卡托普利组和中药高剂量组可显著降低自发性高血压大鼠收缩压；治疗第8周，卡托普利组和中药中、高剂量组均可显著降低自发性高血压大鼠收缩压，与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。中药低剂量组自发性高血压大鼠收缩压与治疗前及模型对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠舒张压的变化表2结果显示：治疗前，各造模组自发性高血压大鼠的舒张压比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗第4周，各治疗组舒张压均有不同程度的降低；治疗第8周，卡托普利组与中药中、高剂量组均可显著降低自发性高血压大鼠舒张压，与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。中药低剂量组大鼠舒张压与治疗前及模型对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组治疗前后收缩压的比较Table 1Comparison of systolic pressure values in various groups，p/mmHg）

表1 各组治疗前后收缩压的比较Table 1Comparison of systolic pressure values in various groups，p/mmHg）

①P＜0.05，与正常对照组比较；②P＜0.05，与模型对照组比较；③P＜0.05，与治疗前比较

组别正常对照组模型对照组卡托普利组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组N888888治疗前116.26±9.56 177.42±3.92①178.38±5.63①177.54±1.79①181.50±3.50①179.58±4.92①治疗4周118.75±7.45 188.25±5.75①180.13±6.38①②184.47±4.25①189.22±2.25①179.51±6.15①②治疗8周122.63±7.71 189.75±10.75①168.64±10.87①②③184.25±9.48①178.48±7.17①②③172.75±9.56①②③

表2 各组治疗前后舒张压的比较Table 2Comparison of diastolic pressure values in various groups，p/mmHg）

表2 各组治疗前后舒张压的比较Table 2Comparison of diastolic pressure values in various groups，p/mmHg）

①P＜0.05，与正常对照组比较；②P＜0.05，与模型对照组比较；③P＜0.05，与治疗前比较

组别正常对照组模型对照组卡托普利组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组N888888治疗前77.66±3.13 107.23±7.15①106.65±10.61①105.63±7.74①109.25±7.71①107.50±6.88①治疗4周73.09±3.58 109.25±7.25①98.38±8.75①②③106.35±6.25①101.38±7.31①97.50±4.85①②③治疗8周76.625±3.62 105.13±7.75①84.44±6.25①②③102.47±6.82①96.65±4.16①②③87.63±6.25①②③

2.3 HE染色法观察各组大鼠胸主动脉改变图1结果显示：正常对照组大鼠的胸主动脉管壁厚度较均匀，内壁较光滑；模型对照组与中药低剂量组胸主动脉管壁增厚、稍僵硬、厚度不均匀，内膜排列不整齐；中药中剂量组血管壁略僵直，内膜排列不甚整齐；卡托普利组与中药高剂量组的胸主动脉壁厚度趋于更均匀，且内壁排列趋于更整齐，2组形态更趋于正常对照组。

图1 各组大鼠胸主动脉病理变化比较（HE染色，×100）Figure 1Comparison of pathological features of thoracic aortas in various groups（By HE staining，×100）

2.4各组大鼠胸主动脉组织学及体视学观测结果表3结果显示：治疗8周后，模型对照组大鼠动脉IMT增厚，管腔较狭窄，IMT/LD显著增高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药高剂量组与卡托普利组的大鼠胸主动脉IMT、IMT/LD显著降低，管腔增大，与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠胸主动脉IMT、LD、IMT/LD值的比较Table 3Comparison of IMT，LD values and IMT/LDratio of thoracic aortas in various groups

表3 各组大鼠胸主动脉IMT、LD、IMT/LD值的比较Table 3Comparison of IMT，LD values and IMT/LDratio of thoracic aortas in various groups

①P＜0.05，与正常对照组比较；②P＜0.05，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组卡托普利组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组N888888 dIMT/μm 49.49±4.40 57.81±8.29①51.26±4.26②57.09±7.12①55.58±4.16①52.74±3.38②dLD/μm 663.33±58.56 585.04±53.58①658.94±69.95②608.44±43.84①630.51±72.10①②654.27±49.53②IMT/LD（×10-2）7.54±1.01 9.52±2.26①7.96±1.20②9.35±0.018①9.07±1.25①8.16±1.45②

2.5 各组大鼠血浆ET-1、NO水平比较表4结果显示，治疗8周后，模型对照组的ET-1增高、NO则降低，与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而中药中、高剂量组及卡托普利组的ET-1水平显著降低，NO水平显著升高，与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。2.6免疫组织化学法检测p-p38MAPK在胸主动脉的表达图2与表5结果显示：与正常对照组比较，模型对照组p-p38MAPK阳性细胞表达数增加；与模型对照组比较，石决牡蛎汤中、高剂量组和卡托普利组则能够显著抑制p-p38MAPK的表达。

表4 各组大鼠血清ET-1、NO水平比较Table 4Comparison of rat serum ET-1 and NO levels in various groups

表4 各组大鼠血清ET-1、NO水平比较Table 4Comparison of rat serum ET-1 and NO levels in various groups

①P＜0.05，与正常对照组比较；②P＜0.05，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组卡托普利组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组N888888 ρET-1/（ng·L-1）35.60±5.21②50.04±7.05①40.54±5.76①②47.21±4.21①45.20±6.28①②42.29±4.43①②cNO/（μmol·L-1）56.49±7.26②38.78±6.30①51.05±5.50②42.78±5.93①44.56±6.27①②48.32±7.64②

表5 各组大鼠胸主动脉p-p38MAPK阳性细胞表达数比较Table 5Comparison of the number of the cells with positive p-p38MAPK expression in rat thoracic aortas of various groups

表5 各组大鼠胸主动脉p-p38MAPK阳性细胞表达数比较Table 5Comparison of the number of the cells with positive p-p38MAPK expression in rat thoracic aortas of various groups

①P＜0.05，与正常对照组比较；②P＜0.05，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组卡托普利组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组N888888 np-p38M APK阳性细胞数4.35±1.08②18.16±3.47①6.81±3.24①②16.42±5.30①10.48±3.35①②8.58±2.76①②

图2 各组大鼠磷酸化p38MAPK在胸主动脉中的表达（免疫组织化学法，×200）Figure 2Comparison of p-p38MAPK expression levels in rat thoracic aortas of various groups（by immunohistochemistry，×200）

3 讨论

血管重构是指血管内径或血管外径和血管壁厚度的适应性变化：其结构变化主要包括血管平滑肌细胞（VSMC）增殖、细胞外基质（ECM）改变、内皮细胞损伤等；其功能变化主要表现为顺应性降低及对血管活性物质的反应性发生改变等。血管重构现象是机体血管对血压升高的适应反应，也是高血压TOD最早的病理改变过程[6]。血管重构在高血压伴发的心、脑、肾等靶器官损害中起着关键的作用。轻度高血压患者心脏和血管即已发生重构，其结构和功能均已受损。因此，本研究以减轻自发性高血压大鼠血管重构为效应目标来探讨石决牡蛎汤抗高血压甚或延缓高血压TOD的机理。

本实验观察不同剂量石决牡蛎汤对自发性高血压大鼠血压、血管组织学及体视学变化，研究结果显示：与治疗前及模型对照组比较，治疗8周后石决牡蛎汤中、高剂量组及卡托普利组的收缩压、舒张压虽未能降至正常对照组水平，但差异均有统计学意义（P＜0.05）；卡托普利组及中药高剂量组的胸主动脉壁厚度较均匀，内壁较整齐光滑，2组形态更趋于正常对照组；中药高剂量组、卡托普利组IMT、LD及IMT/LD值更接近于正常对照组，与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。由此可见，石决牡蛎汤中、高剂量组具有一定血管保护作用。

ET-1具有很强的血管收缩及促进平滑肌细胞增殖的作用，当ET-1释放增加时，提示血管内皮细胞受损[7]。NO是内皮源性舒张因子，NO形成后与受体结合激活鸟苷酸环化酶，促进三磷酸鸟苷酸（GPT）环化而产生环磷酸鸟苷（cGMP），cGMP可通过抑制平滑肌收缩、调节血管舒缩节律等功能[8]。本研究结果显示：治疗8周后，模型对照组血清ET-1水平增高，NO水平降低，表明SHR存在血管内皮损伤；而石决牡蛎汤中、高剂量组及卡托普利组ET-1水平显著降低，NO水平显著升高，与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。再结合这3个有效治疗组大鼠血压及血管组织学变化，我们认为，其血压虽未能降至正常水平，但石决牡蛎汤可能通过降低ET-1含量，增加NO含量，起到舒张血管、抑制血管平滑肌增殖、保护血管内皮的作用。

近年来研究表明，p38MAPK信号通路可参与血管VSMC增殖、ECM合成与降解、内皮细胞损伤等多种病理生理过程，在血管重构中起重要调控作用。因此，p38MAPK有可能成为高血压血管重构的治疗靶点[9]。在受损心脏组织的重塑过程中，p38MAPK发生活化可引起心肌细胞功能障碍[10]。Seiji等[11]研究自发性高血压脑卒中大鼠和WKY大鼠的主动脉平滑肌细胞发现，p38MAPK表达水平在自发性高血压大鼠中显著升高。袁国强等[12]研究表明，抑制p38MAPK通路对TNF-α诱导的EC细胞eNOS表达降低、ET-1表达增高具有拮抗作用。结合以上研究结果，我们认为，中、高剂量石决牡蛎汤可能通过抑制p-p38MAPK的表达水平起到保护血管内皮细胞、抑制血管平滑肌细胞增殖作用的。

综上所述，石决牡蛎汤具有一定的降压作用，并可改善自发性高血压大鼠胸主动脉损害，其原因可能通过对p38MAPK通路的调控和对血浆ET/NO的调节，从而改善自发性高血压大鼠血管重构。

［1］Hassona M D，Elnakish M T，Abouelnaga Z A，et al.The effect of selective antihypertensive drugs on the vascular remodelingassociated hypertension：insights from a profiling transgenic mouse model［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2011，57（5）：550.

［2］Florian G，Karl W，Schmid K，et al.Induction of the matrix metalloproteinase-2 activation system in arteries by tensile stress. Involvement of the p38MAPKinase pathway［J］.Pathol Res Pract，2007，203（3）：135.

［3］梁政，陈灿，黄石安.p38丝裂原活化蛋白激酶与高血压血管重构［J］.医学综述，2008，14（6）：803.

［4］颜芳，赵立诚.邓铁涛治疗高血压病经验［J］.中医杂志，2003，44（8）：574.

［5］高允珊.石决牡蛎汤治疗高血压病60例临床观察［J］.湖南中医杂志，2005，21（40）：10.

［6］Sonoyama K，Greenstein A，Price A，et al.Vascular remodeling：implications for small artery function and target organ damage［J］. Ther Adv Cardiovasc Dis，2007，1（2）：129.

［7］Lerman A，Burnett J C Jr.Intact and altered endothelium in regulation of vasomption［J］.Circulation，1992，86（6 suppl）：Ⅲ12.

［8］Yu J，Zhang Y，Zhang X，et al.Endothelium derived nitric oxide synthase negatively regulates the PDGF-survivin pathway during flow-dependent vascular remodeling［J］.PLoS One，2012，7（2）：e31495.

［9］Fang L，Chen M F，Xiao Z L，et al.The effect of endothelial progenitor cells on angiotensin II-induced proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2011，58（6）：617.

［10］何丹，任朋亮，范雪娇.p38MAPK与疾病关系的研究进展［J］.西部医学，2014，26（2）：259.

［11］Seiji U，Shinji K，Ryo H，et al.Different effects of amlodipine and enalapril on the mitogen-activated protein kinase/extracellularsignalregulated kinase-extracellular signal regulated kinase pathwayforinductionofvascularsmoothmusclecell differentiation in vivo［J］.Hypertens Res，2006，29（3）：179.

［12］袁国强，王玲玲，杨海涛，等.p38MAPK通路在TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞分泌ET-1与eNOS中的作用及通心络干预的影响［J］.中国药理学通报，2009，25（11）：1415.

【责任编辑：黄玲，侯丽颖】

Mechanism Study of Shijue Muli Decoction in Improving Vascular Remodeling of Spontaneously Hypertensive Rat Through p38MAPK Signaling Pathway

TONG Xiaoyun1，ZHOU Min2，YU Maoqiang3，LI Xiao1，ZHANG Li1，XIE Jian1
（1.The First Affiliated Hospital of Yunnan College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650021 Yunnan，China；2.Postgraduates in 2014，Yunnan College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500 Yunnan，China；3.The Second People’s Hospital of Lishui City，Lishui 323000 Zhejiang，China）

ObjectiveTo explore the effect of Shijue Muli Decoction（SMD）on improving vascular remodeling of spontaneously hypertensive rats（SHRs）by p38MAPK signaling pathway.MethodsForty 16-week old SHRs were randomly divided into model control group，high-，middle-and low-dose SMD groups，and Captopril group，8 rats in each group.In addition，8 Wistar-Kyoto rats were used as the blank control group.After 8-week medication，pathological features of thoracic aorta were observed by HE staining，intima-media thickness（IMT）and lumen diameter（LD）were measured by computer image analysis system，serum endothelin（ET-1）level was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），serum nitric oxide（NO）level was detected by nitrate reductase method，and the expression of phosphorylated-p38MAPK（p-p38MAPK）in the thoracic aorta was determined by immunohistochemistry.ResultsCompared with the model control group，the values of systolic blood pressure and diastolic blood pressure as well as ET-1 level were lower and NO level was higher in high-and middle-dose SMD groups and Captopril group，and IMT and IMT/LD were markedly decreased in high-dose group and Captopril group（P＜0.05）.The immunohistochemical results showed that the expression levels of p-p38MAPK in the thoracic aorta were inhibited inhigh-and middle-dose groups and Captopril group.ConclusionSMD can improve vascular remodeling of SHRs through inhibiting p38MAPK signaling pathway and ET/NO system.

Shijue Muli Decoction/pharmacology；hypertension/TCD therapy；vascular remodeling；p38MAPK signaling pathway；disesae models，animal；Rats

285.5

A

1007-3213（2016）06-0846-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.021

2016-07-06

童晓云（1973-），女，副教授，博士研究生；E-mail：1724840697@qq.com

云南省科技厅面上项目（编号：2012FB207）