超声辅助提取荚果蕨总黄酮的响应面优化

施伟梅,夏侯国论,卢 凯

(1.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000；2. 广州城市职业学院科技中心，广东 广州 510405)



超声辅助提取荚果蕨总黄酮的响应面优化

施伟梅1*,夏侯国论2,卢 凯1

(1.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000；2. 广州城市职业学院科技中心，广东 广州 510405)

利用响应面法优化超声辅助提取荚果蕨总黄酮工艺。在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken实验设计，考察了超声温度、乙醇浓度、液料比及超声时间4个因素及因素间交互作用对总黄酮提取率的影响，建立了回归模型。结果表明，超声辅助提取荚果蕨总黄酮的最佳工艺为：超声温度65℃、乙醇浓度60%、液料比21∶1、超声时间35min，在此条件下，总黄酮的提取率为1.256%，与预测值相对误差为0.641%，验证了该模型的有效性，该工艺与传统提取方法相比，提取率提高了18.49%，是一种高效快速提取荚果蕨总黄酮的方法。

荚果蕨；总黄酮；提取；响应面分析

荚果蕨(Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro)又名黄瓜香、野鸡膀子，是球子蕨科荚果蕨属多年生草本植物[1-2]。荚果蕨，具有清热解毒、杀虫、止血的功效，是常用中药贯众[3]的主流品种之一；其幼叶清香可口，质地脆嫩，是营养价值极高的山野菜，更是难得的药、食同源植物。研究表明，荚果蕨富含蛋白质、多糖及多种微量元素，还有黄酮、蜕皮甾酮等活性成分[4-6]。黄酮类化合物是一类拥有多样生物活性的植物次生代谢产物，具有抗衰老、抗癌、抑菌、保健等功效[7-8]，迄今为止，对荚果蕨黄酮的研究报道较少，主要集中在对黄酮成分[9]的研究上，而对荚果蕨黄酮的提取方法还没有系统深入的研究报道。近年来，超声波辅助提取技术由于具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点，被广泛应用于天然产物活性成分的分离提取[10-11]。本实验采用超声辅助提取法对荚果蕨总黄酮的提取工艺进行研究，并以总黄酮提取率为指标，采用响应面统计法优化其超声提取工艺，旨在为进一步研究开发荚果蕨提供依据。

一、实验部分

(一)仪器与试剂

Lambda 35紫外可见分光光度，美国珀金埃尔默公司；KQ3200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司； DHG-9070电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；TDL-50B台式离心机,上海安亭科学仪器厂；Q-250B高速万能粉碎机：上海冰都电器有限公司；AB135-S电子分析天平，上海树信仪表有限公司。

荚果蕨：采于四川省南充西山，在50℃烘箱中烘干至恒重后粉碎，过60目筛，置于干燥皿中密封保存备用；芦丁对照品，中国药品生物制品检定所；乙醇，分析纯，使用时，配制成不同体积浓度的乙醇溶液；其它试剂均为分析纯。

(二)试验方法

1.总黄酮标准曲线的建立

以芦丁为标准品，采用NaNO2-AL(NO3)3比色法[12]，在波长510nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，芦丁质量浓度X为横坐标，绘制标准曲线，

并将实验结果进行线性回归，得回归方程为A=10.89X-0.0029，相关系数R2=0.9993。

将从荚果蕨中提取的待测液用上述方法进行测定，所得的吸光度代入回归方程中得到总黄酮质量浓度，按下式计算总黄酮的提取率。

式中：b为荚果蕨提取液总黄酮的质量浓度，mg/mL；n为提取液稀释倍数；V为提取液体积，mL；W为荚果蕨粉末的质量，mg。

2.荚果蕨总黄酮的乙醇回流提取

荚果蕨粉末2.000g→乙醚脱脂8h→乙醇水浴提取→趁热抽滤→定容→提取液→测吸光度A，计算总黄酮提取率。

3.荚果蕨总黄酮的超声提取

精确称取一定量的荚果蕨粉末，加入一定浓度乙醇，按照设定的程序进行超声辅助提取荚果蕨中的总黄酮，抽滤，滤液定容，测吸光度A，计算总黄酮提取率。

(三)试验设计

1.单因素试验

采用单因素试验研究了超声温度、乙醇浓度、液料比和超声时间对荚果蕨中总黄酮提取效果的影响。

2.响应面试验设计

以单因素试验为基础，采用Design-Expert8.0.6软件数据分析，根据Box-Behnken建立数学模型，以超声温度(X1)、乙醇浓度(X2)、液料比(X3)和超声时间(X4)为自变量，+1、0、-1代表自变量的高、中、低水平，荚果蕨总黄酮提取率(Y)为指标，进行响应曲面分析，因素水平设计见表1。

表1 响应曲面因素与水平表

3.验证与比较试验

通过软件分析获得最佳提取工艺条件后，按照优化条件进行提取测定，比较实验结果和方程计算值的差异。并将该实验结果与传统乙醇提取结果进行对比，探讨2种方法对荚果蕨总黄酮提取效果的影响。

二、结果与分析

(一)单因素试验

1.超声温度对总黄酮提取率的影响

1.31.21.11.00.90.8提取率/%超声温度/℃5560657075

图1 超声温度对总黄酮提取率的影响

固定乙醇浓度为70%、液料比为20∶1、超声时间为30min，考察了不同超声温度对总黄酮提取率的影响，结果如图1所示。从图1可看出，随着温度升高，总黄酮提取率不断升高，65℃时达到最大，继续升高温度，提取率反而下降。这是因为随着温度升高，增加了溶液中总黄酮的溶解性，超出65℃之后，由于温度过高，会导致黄酮类物质被氧化而使得提取率降低，因此，最佳的温度选择为65℃。

2.乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

固定超声温度为65℃、液料比为20∶1、超声时间为30min，考察了不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，结果如图2所示。从图2可看出，荚果蕨总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加，呈先增加后降低的趋势，乙醇浓度为60%时，提取率达到最高。这可能是因为随着乙醇浓度的增加，溶剂的极性减小，增大了黄酮类物质的溶解性；当乙醇浓度超过60%后，荚果蕨中一些极性较弱的成分不断溶出，增加了与黄酮类物质的溶出竞争[13]，导致总黄酮提取率下降。因此，最佳乙醇浓度选定为60%。

固定超声温度为65℃、乙醇浓度为60%、超声时间为30min，考察了不同液料比对总黄酮提取率的影响，结果如图3所示。从图3可看出，随着液料比的增加，荚果蕨总黄酮的提取率逐渐增加，当液料比为20∶1时，总黄酮提取率达到最大，继续增大液料比，反而导致提取率降低。这是因为随着液料比的增大，溶剂与荚果蕨的接触面积增加，荚果蕨颗粒内外的浓度差增大，增加了传质推动力，使总黄酮更易溶出与扩散；当液料比超过20∶1时，溶剂量过大，增加了浓缩过程中总黄酮的损失[14]，造成了总黄酮提取率的下降，因此，最佳的液料比选择为20∶1。

1.31.21.11.00.90.8提取率/%超声温度/℃5560657075

图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

图3 液料比对总黄酮提取率的影响

图4 超声时间对总黄酮提取率的影响

3.超声时间对总黄酮提取率的影响

固定超声温度为65℃、乙醇浓度为60%、液料比为20:1，考察不同超声时间对总黄酮提取率的影响，结果如图4所示。从图4可看出，随着超声时间的延长，总黄酮的提取率增大，当超声时间为35min时，总黄酮提取率达到最大值，继续增加超声时间，总黄酮提取率反而有所下降。这是因为超声时间过长，容易使黄酮类物质氧化而破坏。另外，超声时间过长，溶出的杂质增加，将抑制黄酮类物质的溶出，而最终导致总黄酮提取率的下降。因此，最佳超声时间选择为35min。

(二)响应面试验结果

1.响应面试验结果及方差分析

根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，选取超声温度(X1)、乙醇浓度(X2)、液料比(X3)和超声时间(X4)四个因素进行优化实验，实验因素和水平设计表见表2，响应面分析方案见表3。

表2 响应曲面试验以及响应值

表3 响应曲面方差分析表

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

表4 Box-Behnken 的试验设计和实验结果

从方差分析表3可知，由试验数据所得模型失拟度F=29.50，P <0.0001，表示该模型显著。由模型拟合得到的回归方程为： Y=-24.55+0.52X1+0.16X2+0.04X3+0.20X4+4.50×10-4X1X2+1.10×10-4X1X3+9.30×10-4X1X4+3.00×10-5X2X3+1.04×10-3X2X4-1.40×10-4X3X4-4.48×10-3X12-1.86×10-3X22-1.01×10-3X32-4.50×10-3X42，其方程的R2为0.967 2。方程中P<0.05 的项代表显著项，包括X1、X3、X4及二次项X1X4、X2X4、X12、X22、X32、X42，表明各影响因素与响应值的关系并不是简单的线性关系，各因素之间的交互作用对荚果蕨总黄酮的提取有影响。方程的失拟度F=2.43，P=0.203 3>0.05，表示失拟度不显著，说明该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。由表4可知，该模型的调整系数为0.9344，表明荚果蕨总黄酮提取率的实际值与预测值之间具有很好的拟合度，可以用该模型对荚果蕨总黄酮的提取率进行预测和分析。

2.试验因素交互作用对响应值影响的3D分析

各试验因素及其交互作用对响应值的影响可以通过响应面3D图直观反映出来，结果见图5。由图5可知，并不是所有因素对荚果蕨总黄酮的提取都有显著的影响，超声温度的影响最为显著，随着超声温度的升高，总黄酮提取率随之增大，随后超声温度继续增大，总黄酮提取率则明显下降，表现为曲面较陡; 超声时间的影响次之，表现为曲面较平缓，响应值变化较小；乙醇浓度和液料比对总黄酮提取率的影响不显著，曲面基本表现为平直线。各具体试验因素对响应值的影响大小是不同的，主次因素顺序为超声温度>超声时间>乙醇浓度>液料比。

3.最佳提取工艺的优化及验证

根据回归模型，利用Design-Expert8.0.6软件对实验数据进行分析，得到最优提取工艺为：超声温度65.46℃、乙醇浓度60.19%、液料比为21.39∶1，超声时间35.36min，荚果蕨总黄酮提取率最大预测值为1.248%。为检验模型的可靠性，对上述最优提取条件进行了提取试验。考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：超声温度65℃、乙醇浓度60%、液料比为21∶1，超声时间35min。在此条件下进行3次平行试验，实际提取率平均值为1.256%，略高于DesignExpert软件的预测值，测定结果重现性良好，相对于预测值，误差为0.641%，验证了该数学模型的有效性。且该超声辅助提取工艺与传统乙醇提取法相比，提取率提高了18.49%，详见表5。可见，采用响应面法优化得到的提取条件参数可靠，得到的总黄酮提取条件具有实际应用价值。

三、结论

采用响应面法对超声辅助提取荚果蕨总黄酮的工艺进行优化，建立数学模型。利用模型方程优化出荚果蕨总黄酮的最佳提取工艺为：超声温度65℃、乙醇浓度60%、液料比为21:1，超声时间35min。经过验证，实际提取率为1.256%，理论值为1.248%，其相对误差为0.641%，说明实际值与预测值拟合度良好。模型响应曲面图表明影响荚果蕨总黄酮提取率的因素依次为：超声温度>超声时间>乙醇浓度>液料比。该工艺相比于传统提取工艺，提取率提高了18.49%。响应面法对荚果蕨总黄酮的提取条件优化合理可行，为提高荚果蕨总黄酮的提取率提供了理论依据。

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(责任编辑 潘志和)

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Flavonoids fromMatteucciastruthiopteris(L.) Todaro

SHIWei-mei1，XIAHOUGuo-lun2，LUKai1

(1.College of Pharmacy, Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China;2. Science & Technology Center, Guangzhou City Polytechnic, Guangzhou 510405, China)

Response surface methodology was used to determine optimum condition for ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromMatteucciastruthiopteris(L.) Todaro. The extraction temperature, concentration of ethanol, liquid-solid ratio and extraction time were chosen to carry out the single factor experiment. The effect of each factor and their interactions on total flavonoids was studied according to the Box-Behnken response surface methodology, and the regression model was established. The results showed that the optimum extraction condition was: extraction temperature 65℃, concentration of ethanol 60%, liquid-solid ratio 21:1 and extraction time 35min, respectively. Under these conditions, the yield of total flavonoids was 1.256%. Compared to the predictive value the relative error was 0.641%, indicating that the regression model fitted well with the experimental data. Moreover, the extraction yield was increased by 18.49% as compared to the traditional extraction method, stated that it could be a rapid and efficient extraction method for flavonoids fromMatteucciastruthiopteris(L.) Todaro.

Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro; flavonoids; extraction; response surface methodology

2016-09-10

江西省教育厅科学技术研究项目(150949)；赣南医学院科研课题(YB201429)

施伟梅，女，赣南医学院药学院讲师。

R284.2

A

1674-0408(2016)04-0030-07