前列腺素E2诱导前列腺间质细胞肌成纤维细胞表型转化和白细胞介素-8的表达

田亚琼，张 琚，彭雁飞，刘树业△

(1.天津市第三中心医院检验科 300170；2.南开大学生物活性材料教育部重点实验室,天津 300071；3.天津中医药大学中西医结合学院生物化学教研室，天津 300193)



·论 著·

前列腺素E2诱导前列腺间质细胞肌成纤维细胞表型转化和白细胞介素-8的表达

田亚琼1，张 琚2，彭雁飞3，刘树业1△

(1.天津市第三中心医院检验科 300170；2.南开大学生物活性材料教育部重点实验室,天津 300071；3.天津中医药大学中西医结合学院生物化学教研室，天津 300193)

目的 探讨前列腺素E2(PGE2)在前列腺间质活化过程中的作用。方法 体外培养人前列腺间质细胞人正常前列腺基质永生化细胞(WPMY-1)，用二甲基亚砜(DMSO)和10-9mol/L前列腺素E2(PGE2)处理后进行免疫荧光染色，检测肌成纤维细胞表型的变化。实时定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞中炎性因子白细胞介素-8(IL-8)的表达，并测定IL-8的浓度。结果 PGE2显著增加WPMY-1细胞中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白共定位的细胞比例。PGE2促进WPMY-1细胞中IL-8的表达。结论 PGE2能增加体外培养的WPMY-1肌成纤维细胞表型，促进IL-8的表达，在前列腺癌发生、发展中具有重要的作用。

间质细胞活化； 荧光染色； 成纤维细胞表型

上皮细胞转变成活化的间质细胞[1]，活化间质在前列腺上皮内瘤(PIN)组织中出现，表现出波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)共定位的肌成纤维细胞表型[2]。从前列腺癌组织中分离出的活化间质细胞与良性前列腺增生的上皮细胞系BPH-1在裸鼠体内重构能够诱导出前列腺癌，而从正常前列腺组织中分离的间质细胞没有这个作用，表明活化的间质细胞能促进前列腺癌发生[3]。活化的间质细胞能够分泌胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和肝细胞生长因子(HGF)促进癌细胞增殖和侵袭[4]，分泌CXCL12促进血管生成和癌细胞迁移[5]，分泌白细胞介素(IL)-6促进上皮细胞增殖[6]。

与正常组织相比，前列腺癌和PIN组织中环氧合酶-2(COX-2)的表达升高[7]，其产物PGE2在前列腺癌组织中的表达显著升高[8]。PGE2能够促进PIN细胞和癌细胞的增殖以及血管形成[9-11]，也通过PI3K/Akt/mTOR信号通路介导癌细胞的迁移和侵袭[12]。研究发现PGE2能够通过诱导前列腺间质细胞旁分泌基质衍生因子-1(SDF-1)从而促进癌细胞的迁移[13]，提示PGE2可能诱导间质细胞活化。文献报道，IL-8能够促进前列腺间质细胞的活化，增加α-SMA和波形蛋白共定位的肌成纤维细胞的表型[14]。本研究检测了PGE2对人正常前列腺基质永生化细胞(WPMY-1)中IL-8表达和肌成纤维细胞表型的调节，结果表明，PGE2能够促进IL-8的mRNA和蛋白表达，同时发现PGE2能够显著增加共表达α-SMA和波形蛋白的细胞比例。

1 材料与方法

1.1 材料 人前列腺间质细胞WPMY-1 购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。

1.2 试剂 改良杜氏伊格尔(DMEM)培养液，购于美国Sigma公司；5%胎牛血清，购于美国Invirogen公司；PGE2，购于美国Cayman Chemical公司；α-SMA抗体，购于北京博奥森公司；Vimentin，购于武汉博士德公司；荧光二抗Alexa Fluor®488 驴抗兔IgG(H+L)及Alexa Fluor®594 驴抗小鼠IgG(H+L)，购于美国Invitrogen公司；M-MLV反转录试剂盒，购于美国Promega公司；UltraSYBR Mixture，购于北京康为世纪公司；人IL-8引物，购于生工生物工程(上海)股份有限公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，购于武汉博士德公司。

1.3 实验设备 荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)仪，购于美国MJ Research公司；倒置荧光显微镜，购于Nikon公司；紫外光可见光分光光度计，购于Pharmacia公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养人前列腺间质细胞WPMY-1使用含有5%胎牛血清的DMEM培养液置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.4.2 免疫荧光染色将体外培养的WPMY-1细胞种植在直径为1.5 cm的圆玻璃片上，细胞贴壁后，换成含有1%活性炭处理血清继续培养36 h，分别使用DMSO和10-9mol/L PGE2处理细胞96 h。预冷的丙酮固定细胞后使用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再用含有10%胎牛血清的PBS封闭。α-SMA抗体和Vimentin用来孵育细胞玻片，荧光二抗为Alexa Fluor®488驴抗兔IgG(H+L)及Alexa Fluor®594驴抗小鼠IgG(H+L)。

1.4.3 实时定量PCR检测细胞中IL-8的表达将体外培养的WPMY-1种植在6孔板中，细胞贴壁后，换成含有1%活性炭处理血清继续培养36 h，分别使用二甲基亚砜(DMSO)和10-9mol/L PGE2处理细胞24 h。Trizol法提取细胞总RNA，对RNA进行反转录，进行实时定量聚合酶链反应(PCR)检测。人IL-8引物上游序列：5′-CTC TGG CAG CCT TCC TGA TT-3′;下游序列:5′-TAT GCA CTG ACA TCT AAG TTC TTT AGC-3′。

1.4.4 条件培养液中IL-8浓度的测定将体外培养的WPMY-1种植在6孔板中，细胞贴壁后，换成含有1%活性炭处理血清继续培养36 h，分别使用DMSO和10-9mol/L PGE2处理细胞48 h。收集各孔细胞的条件培养液，并对每孔细胞进行计数。检测条件培养液中IL-8的浓度，并根据细胞数计算同等细胞数IL-8 分泌的差别。

2 结 果

2.1 PGE2增加体外培养的WPMY-1肌成纤维细胞表型 体外培养的WPMY-1,分别种植在6张圆玻璃片上,1%活性炭血清处理36 h后，分别用DMSO和10-9mol/L PGE2处理WPMY-196 h，通过α-SMA(绿色荧光)和Vimentin(红色荧光)的表达检测细胞表型的变化，该实验重复3次，每张圆片随机选取5个视野，使用荧光显微镜进行拍照分析。结果表明，PGE2显著增加WPMY-1中α-SMA和Vimentin共定位的细胞比例。

2.2 PGE2促进WPMY-1细胞中IL-8的表达 将体外培养的WPMY-1细胞分别种植在两个6孔板中，1%活性炭血清培养36 h后，每板中3个孔作为对照组，3个孔用10-9mol/L PGE2处理，24 h后提取总RNA，在48 h后收集两组细胞的条件培养液并细胞计数。通过实时定量PCR检测两组细胞中IL-8 mRNA相对持家基因HpRT的表达量，用2-ΔΔCT方法进行计算，结果表明PGE2能够上调WPMY-1细胞中IL-8的表达。同时，ELISA分析显示PGE2处理的WPMY-1细胞的条件培养液中IL-8蛋白的浓度显著高于DMSO处理组。见图1。

注：A为PGE2处理WPMY-1细胞24 h后；B为PGE2处理WPMY-1细胞48 h后。与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

图1 WPMY-1细胞中IL-8 mRNA的表达和IL-8蛋白的浓度

3 讨 论

肿瘤微环境是近十年来发展最快的研究领域之一，越来越多的证据表明前列腺癌的发展很大程度上依赖于其所处的微环境。前列腺间质细胞在前列腺癌发生、发展的过程中转变为类似于损伤修复过程中出现的肌成纤维细胞表型，因此也有学者将癌症称为永不愈合的损伤。癌间质中的肌成纤维细胞也被称为癌相关成纤维细胞(CAF)，通过旁分泌细胞因子和炎症因子构建适合癌细胞生长和有利于免疫逃逸的微环境，因此可作为癌症治疗中的有效靶标。活化间质细胞的确切来源目前还不是十分清楚，其主要来源被认为是由病灶周围正常的成纤维细胞通过间质-间质转化(MMT)转变为具有肌成纤维细胞表型的活化间质细胞[15]。间质细胞活化的机制还不完全清楚，文献表明转化生长因子β(TGF-β)、IL-6和IL-8是介导前列腺间质细胞活化的关键因子[14,16-17]。

PGE2是COX-2催化花生四烯酸产生的一种重要物质，能够通过与细胞膜受体的结合激活下游信号通路，引起细胞生理改变，COX-2/PGE2信号通路在介导炎性反应和癌症进程中起到关键作用。然而，COX-2/PGE2信号通路与CAF的关系仍不清楚，研究表明，PGE2能够诱导体外培养的前列腺间质细胞WPMY-1中IL-8的表达，并且能够诱导WPMY-1细胞转变为肌成纤维细胞。这一结果表明，前列腺癌中高表达的COX-2，可以通过局部PGE2浓度的升高诱导前列腺间质细胞的活化，并且IL-8可能参与介导了这一过程。

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Prostaglandin E2 induced myofibrolast phenotype inversion and interleukin 8 expression in prostate stromal cells

TIANYaqiong1,ZHANGJu2,PENGYanfei3,LIUShuye1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinMunicipalThirdCentralHospital,Tianjin300170,China;2.KeyLaboratoryofBioactiveMaterialsofEducationMinistry,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;3.TeachingandResearchSectionofBiochemistry,ChineseandWesternMedicineInstituteTianjinChineseMedicineUniversity,Tianjin300193,China)

Objective To investigate the effects of prostaglandin E2(PGE2) in prostate mesenchymal cell activation.Methods To culture human prostate stromal cells WPMY-1 in vitro,implement immunofluorescence staining after treating with DMSO and 10-9mol/L PGE2 and detect the change of the myofibroblast phenotype.The expression of cellular inflammatory factor interleukin 8(IL-8) was detected by real-time quantitative PCR and the concentration of IL-8 was detected.Results PGE2 significantly increased the cellular proportion of colocalization with alpha SMA and Vimentin in WPMY-1 cells.PGE2 promoted the expression of IL-8 in WPMY-1 cells.Conclusion PGE2 can increase myofibroblast phenotype in human prostate mesenchymal cells WPMY-1 in vitro culture,promotes the IL-8 expression,which has an important role in the occurrence and development of prostate cancer.

mesenchymal cell activation; immunofluorescence staining; myofibroblast phenotype

田亚琼，女，技师，主要从事代谢组学以及分子生物学的研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.023

A

1673-4130(2016)23-3300-03

2016-04-28

2016-07-12)