生物敏感MRI造影剂的研究新进展

刘云，张蕾磊，胡海宇，姚庆强



生物敏感MRI造影剂的研究新进展

刘云，张蕾磊，胡海宇，姚庆强

磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）以其非侵入性，无辐射损伤，无骨质伪影，安全性好，空间分辨率和对比度高，可向任意方位断层扫描等技术灵活性，成为了临床医学诊断的重要手段。但是，某些不同组织或肿瘤组织的弛豫时间差别较小，成像时很难获得足够的信号差，造成 MRI 诊断困难，不能进行动态扫描和测定器官的功能等缺陷，因此需在被检测对象中加入一类能改变氢质子弛豫时间的物质来提高磁共振成像的敏感性和分辨率，这种物质被称为磁共振成像造影剂。临床上 50% 以上的磁共振扫描需要用造影剂来增强成像对比度。

MRI 造影剂主要是一些顺磁性或超顺磁性物质，通过缩短体内局部质子弛豫时间（加快弛豫速率），提高正常部位与患病部位的成像对比度，从而显示体内器官的功能状态。根据弛豫理论和 SBM（Solomon-Bloembergen-Morgan）方程[1]可知，影响造影剂弛豫速率的主要因素包括配位水分子数目（）、配位水分子交换速率（τM）和配合物旋转相关时间（τR）。因此，提高造影剂的弛豫效率可通过增加化合物配位水分子的数目，提高配位水分子的交换速率以及延长配合物的旋转相关时间来实现。

自 1988 年第一个 MRI 造影剂钆-二乙三胺五乙酸（Gd-DTPA）投入市场以来，研究者对 MRI 造影剂进行了更加深入的研究，以提高磁共振成像的灵敏度、对比度和特异性。目前应用于临床 MRI 诊断的造影剂多数为非特异性造影剂，属于胞外试剂，仅局限于解剖学特征的增强，无法检测生物体内的生化过程。因此，研发一类智能型或生物敏感型 MRI 造影剂是当前的发展热点，这类造影剂的弛豫率受生理条件或活动的调节，比如酶、金属离子浓度、pH 值、温度等，并对生理环境的改变做出相应的改变，因而能够用来监测生物体内的生理和新陈代谢过程[2-3]。研究表明，智能型 MRI 造影剂不仅能够提高 MRI 对病变的检测灵敏度，而且能够针对病变的信号分子进行分子成像，从而实现对生物活性分子、生理变化和其他分子进行功能性检测与成像。

1 酶激活造影剂

临床上，多种疾病都伴随着酶含量和活性的改变，通过设计合成一类酶激活造影剂可以检测特定酶的活性及分布进而判断疾病的状态，其设计思路是：将造影剂与某些酶底物基团相连，此时造影剂处于“磁共振静默”状态，即弛豫效能较低，成像较弱，而当病变或者生理环境改变使特定的酶生成时，酶的裂解作用导致相关基团离去，使造影剂的弛豫效能大大增加，成像对比度增强。因此发展酶激活的 MRI 造影剂无损伤地检测体内酶活性和分布对于疾病的诊断具有重要意义。

Meade 课题组最先合成了一类酶激活造影剂，即由β-半乳糖修饰的钆配合物-Egad Me 类化合物，在 β-半乳糖水解酶（GAL）存在时，β-半乳糖基团被水解离去，此时水分子参与配位，使得弛豫率有了较大的提高[4-5]（图 1A）。临床上可利用该造影剂检测尿中 GAL 的活性，进而用于肾小管早期损伤的诊断。Chen 等[6]报道了一种对 β-葡糖苷酸酶敏感的造影剂 [Gd(DOTA-FPβGu)]（图 1B），其结构是由 Gd 配合物和 β-葡糖苷酸酶底物（β-D-葡糖醛酸）两部分构成。β-葡糖苷酸酶是一种关键的溶酶体酶，其在肿瘤坏死中过表达。在 β-葡糖苷酸酶和人血清白蛋白（HSA）存在时，其弛豫效能显著升高，且弛豫率的改变与 β-葡糖苷酸酶的浓度有关。另外，该造影剂在动物肿瘤模型中成像较好，能被用于肿瘤组织中 β-葡糖苷酸酶活性的检测，从而有效诊断和治疗癌症。

B

Giardiello 等[7]开发了一类 Gd-大环多胺造影剂，该造影剂能被酯酶激活，其结构中带有 3 个乙酰氧甲基，理论内层配位水分子数目为 2，但由于体内血清中含有丰富的 HCO3-等阴离子，与配合物有高度的亲和力，阻止了水分子和 Gd 的配位。当造影剂进入细胞内，结构中的乙酰氧甲酯被细胞内酯酶裂解成带有 3 个负电荷的配合物，抑制碳酸盐的配位，从而使内部水分子能与 Gd 配位，配位水分子数目从 0 增加到 2，且弛豫率增加 84%（图 2），可作为潜在的细胞 MRI 造影剂。

q = 0 q = 2

Aswendt 等[8]报道了一种对神经元中的谷氨酸脱羧酶（GAD）敏感的 MRI 造影剂Gd-DO3A-GAD（图 3）。当 GAD 存在时，结构中已配位的谷氨酸基团被裂解，使得 Gd 中心能与水分子发生配位，其弛豫率增加。此外，被裂解的谷氨酸基团能生成一种带正电荷的化合物，与带负电荷的大分子发生静电相互作用，从而使弛豫率进一步增加。因此，该造影剂能够用于诊断和治疗脑疾病，如中风或亨廷顿舞蹈症。

Ye 等[9]设计合成了一类半胱天冬酶（细胞凋亡蛋白酶）激活的 Gd-造影剂 C-SNAM（图 4），用于成像药物诱发的细胞凋亡。该结构由一个 2-氰基-6-羟基喹啉（CHQ）、一个 D-半胱氨酸残基、DEVD 肽、去掉二硫键的细胞内谷胱甘肽（GSH）和 Gd-DOTA 单酰胺螯合物组成。半胱天冬酶存在时，造影剂发生生物相容性分子内环合，随后自我组装成 Gd-纳米颗粒（GdNPs），其弛豫率从 10.2 L/(mmol·s) 增加到19.0 L/(mmol·s)，增加了 86%，且保留时间延长，能被用于体内肿瘤细胞凋亡的高分辨成像。

图 3 谷氨酸脱羧酶激活的 MRI 造影剂Gd-DO3A-GAD

图 4 半胱天冬酶激活的 Gd-造影剂 C-SNAM

Rolla 等[10]设计合成了一种对酪氨酸酶敏感的 Mn 类造影剂，在氨基羧酸位置引入 L-酪氨酸残基，其配体分别为 L1、L2和 L3（图 5）。酪氨酸酶是在黑素瘤癌细胞中过表达的一种氧化还原酶。在酪氨酸酶的作用下，MnL1和 MnL2不断释放 Mn2+离子，MnL3生成一种低聚物，使其弛豫速率大大提高。另外，Mn2+还可与蛋白质产生相互作用，使弛豫率进一步得到提高。结果显示，MnL1、MnL2和MnL3的弛豫率分别提高了 50%、200%、250%。因此，这类造影剂可作为诊断探针用于检测黑色素瘤。

L1 L2 L3

近年来，一种新型的化学交换饱和转移（CEST）MRI 造影剂逐渐发展起来。此类造影剂带有不稳定的质子，能够选择性饱和，使得 MRI 信号快速消失，这种质子能够与水分子交换，将饱和的质子转移到水分子中，从而降低水分子的信号（T1 和 T2）产生阴性对比[11]。

Li 等[12]报道了一类能检测酯酶活性的 PARACEST 造影剂 Yb-(DO3A-oAA-TML-ester)，该配合物结构中的内酯基团被酯酶水解，后触发分子发生内酯化，导致酰胺键断裂变为氨基，进而产生 CEST 效应（图 6A）。最近，Fernández-Cuervo 等[13]开发出一类能同时检测两种酶（硫酸酯酶和酯酶）活性的抗磁性化学交换饱和转移（DIACEST）造影剂（图 6B），来提高疾病诊断的特异性。该造影剂能被硫酸酯酶和酯酶裂解，释放出能被 CEST MRI 探测到的水杨酸，且该造影剂必须被这两种酶激活才能产生响应，缺乏任何一种酶都很稳定。这些结果证实开发这类造影剂可以作为一种平台技术用于设计能检测酶活性的造影剂。

2 金属离子敏感造影剂

在生命活动中，许多金属离子如 Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+/Fe3+等在生物体内发挥着重要作用和功能。研究发现，多数金属离子与各种疾病状态密切相关，因此研究对生物体内某些金属离子敏感的造影剂成为一个新的研究领域，逐渐应用于多种疾病的诊断。

Li 等[14]报道了第一个钙敏感造影剂 Gd-DOPTA。当 Ca2+存在时，Ca2+取代Gd3+与 BAPTA 中的羧基发生配位，使得水分子能与 Gd3+配位，从而提高配合物的弛豫效能（图 7）。最近，Tanwar 等[15]设计合成了一种对 Ca2+有高度选择性的造影剂Gd-DO3A-AME-NPHE（图 7），其结构由一个 Gd-DO3A 中心与亚氨基醋酸酯结合组成。在 Ca2+存在时，其内层配位水分子数由 0.2 增加到 1.05，弛豫率增加了 60%。结果表明，该结构对 Ca2+具有高度选择性，而对其他金属离子（K+、Na+、Mg2+、Zn2+）不敏感。为实现体内中枢神经系统 Ca2+通量的可视化，MacRenaris 等[16]报道了一类细胞酯酶激活的 Ca2+敏感造影剂 DOPTA-Ethyl-Gd（图 7）。结构中 BAPTA 的羧基通过酯化被保护起来，既增加了亲脂性和细胞渗透性，同时避免了与细胞外 Ca2+的结合。当造影剂进入细胞后，其内源性酯酶裂解酯基，暴露羧基与细胞内 Ca2+结合，使水分子与 Gd3+配位，增加造影剂的弛豫率。该类造影剂能够区别细胞内外的 Ca2+，可用于诊断癫痫或缺血的 Ca2+成像。Gündüz 等[17]研发了一种新型树枝状 Ca2+敏感造影剂 DSCA（图 7）。该造影剂由单体类似物制备而成，延缓了其在体内中枢神经系统的扩散速率，增强弛豫效能，同时保持了活性和生物敏感性，在大鼠大脑皮层中树枝状造影剂的扩散性能比其单体类似物更好，成像对比度更高。因此，在生物功能动态 MRI 应用中，体内缓慢扩散的造影剂具有更大的优势，实现神经元活动的钙信号可视化，有助于深入了解大脑功能。

最近，Pope 和Laye[18]合成了一种 Eu-DO3A锌敏感造影剂，将二吡啶甲基氨基甲基-吡啶基团连接到 DO3A 上，并与水化状态= 0.2 的金属中心结合。Zn2+存在时，二吡啶甲基氨基甲基-吡啶基团会与 Zn2+结合，使水分子能以= 2 的水化状态与 Eu 配位。在生理 pH 条件下的水环境中，该复合物对 Zn2+有选择性，且弛豫效能会发生明显的变化。Regueiro-figueroa 等[19]研发了一类对 Zn2+有选择性的 MRI 造影剂，其配体为 DO3A-NO2A（图 8），将 Gd-DO3A 配合物通过 N-丙基乙酰胺与 NO2A 部分相连。当 1:1 加入 Zn2+时，N-丙基乙酰胺部分能与 Zn2+结合，引发水分子与 Gd3+配位，弛豫率从 3 L/(mmol·s) 增加到 7.5 L/(mmol·s)，增加了 150%。另外，Ca2+和 Mg2+有非常微弱的弛豫改变，证明该造影剂对 Zn2+敏感性强。为增强 MRI 检测灵敏度，Yu 等[20]设计出一种新型的对 Zn2+敏感的造影剂 GdDOTA-diBPEN（图 8），该造影剂具有完善的水交换性能，通过提高内外层水分子的交换率，显著增强其纵向弛豫效能，从而提高 MRI 的检测灵敏度。在 Zn2+与人血清白蛋白（HSA）存在时，结合表现出非常高的纵向弛豫率。且体内实验证明，在小鼠体内的葡萄糖刺激胰腺分泌胰岛素时，Zn2+释放，这种新型的高弛豫造影剂能成功用于体内 Zn2+成像。

AB

Gd-DOPTA Gd-DO3A-AME-NPHE

DOPTA-Ethyl-Gd

DSCA

DO3A-NO2A GdDOTA-diBPEN

Que 等[21]报道了一系列 CG2 类铜敏感造影剂，结构中 DOTA 的一个侧链被连有铜结合部位-硫醚的吡啶基所取代。在铜离子存在时，其水化状态从 1 增加到 2，弛豫率从1.5 L/(mmol·s) 增加到 6.9 L/(mmol·s)（图 9），且随着铜结合部位所含硫原子的数目逐渐增加，造影剂对铜离子的选择性越强。后来，Que 课题组[22]设计合成了一种细胞渗透性 Cu+敏感造影剂 Arg8CG2（图 9），即在 CG2 上再加上一个聚精氨酸附属物 Arg8（促进细胞吸收）。与上述报道的 CG2 类造影剂相比，无 Cu+时，Arg8CG2 的弛豫率就明显高于前体复合物 CG2，这可能是由于大分子的穿膜基团 Arg8增加了其旋转相关时间（τR），以及精氨酸残基上多余的氢键基团增加了第二层水分子的配位；加入 Cu+后，1弛豫率增加了 220%，对 Cu+有高度选择性。以 Menkes 综合征细胞模型进行弛豫率测定和 T1 加权成像，证明 Arg8CG2 可以区分疾病模型中正常和异常的铜转运蛋白，因此能适用于体内铜离子异常的疾病成像诊断，逐渐应用于多种动物模型影像学研究。Xiao 等[23]研发出一类对 Cu2+高度敏感的 MRI 造影剂 Gd2(DO3A)2BMPNA（图 9），包括两个Gd-DO3A 中心和一个 BMPNA 基团。当 Cu2+存在时，原吡唑环上与 Gd3+配位的 N 原子被内层水分子取代，Cu2+与该 N 原子结合，弛豫率从 6.40 L/(mmol·s) 增加到 11.28 L/(mmol·s)。与其他生物相关的金属离子相比，该复合物对 Cu2+具有较高的选择性，可用于体内分子成像。

3 pH 敏感造影剂

理想的 pH 敏感造影剂不仅能够对病变部位进行特异性增强成像，提高 MRI 检测疾病的灵敏度，而且可通过检测病变组织中的 pH 变化，为疾病的诊断提供依据。这类造影剂能够在特定的 pH 条件下产生弛豫率的变化，这种变化与金属中心周围水化状态的改变有关。在体内不同细胞和组织的 pH 不同，正常细胞外介质的 pH 为 7.4，而癌细胞外的 pH 为 6.8，因此，pKa值在 7 左右的造影剂可提高肿瘤成像的对比度，进而用于体内癌细胞的成像。

Woods 等[24]报道了一类含有硝基酚侧链的 Gd-DO3A 螯合物，其配体分别为NP-DO3A和NP-DO3AM（图 10）。研究表明，两者都对 pH 敏感，但作用机制不同。Gd(NP-DO3A) 由于硝基酚侧链的解离，弛豫效能从 pH 9 时的 4.1 L/(mmol·s) 增加到 pH 5 时的 7.0 L/(mmol·s)，且不受内源性离子的影响；而以酰胺基取代醋酸的 Gd(NP-DO3AM)，其减弱的给电子能力使 Gd 缺电子难以释放硝基酚，即在较低的 pH 下酚醛质子与水分子间的质子交换率增加。

Frullano 等[25]合成了一类 MR-PET 双模造影剂GdDOTA-4AMP-F（图 10）。该造影剂在水溶液中以高电荷亲水性的 GdDOTA-4AMP 配合物与 F 原子（18F或19F）结合，能在 MRI 中定量监测 pH。在等渗盐溶液中测定时，当 pH 从 8.5 降到 6.0 时，弛豫率从 3.9 L/(mmol·s) 增加到 7.4 L/(mmol·s)，增加了 90%；在兔血浆中测定时，弛豫率变化类似，说明在体内即使有蛋白质结合，该造影剂仍然有效。这种双模式智能 MRI 探针的弛豫变化与生理环境改变成比例，在检测 pH 值的同时可以直接量化。

Gianolio 等[26]报道了一类新的 MRI/SPECT双模造影剂，Gd(III)-L和 Ho(III)-L螯合物（图 10）。这两个造影剂结构仅仅是镧系离子不同，其中 Gd(III) 作为 MRI 活性部位，Ho(III) 作为 SPECT 活性部位。研究表明，在 pH由 8 降低到 5 时，Gd(III)-L 结构中磺酰胺基团发生质子化，与 Gd配位的 N 原子被水分子取代，弛豫率增加了 200%；而Ho(III)-L 的磁性特征使它成为位移试剂而非弛豫试剂，用来检测造影剂的浓度。两者在体内有相同的生物分布，其混合物即可作为一个双模 MRI/SPECT 探针。这一研究证明基于两个“化学等价”的镧系（III）配合物设计合成出一种对 pH 敏感的 MRI/SPECT 双模试剂是可行的，通过合理设计 L 配体的结构，可以满足不同的临床应用，如检测酶活性或代谢产物的浓度。

最近，Bhuiyan 等[27]报道了一类基于树枝状聚合物的pH 敏感造影剂(GdDOTA-4AmP5-)44-G5（图 10），在G5-PAMAM 树状大分子表面通过异硫氰基连接 44 个 GdDOTA-4AmP5-螯合物，这种新化合物能降低表面负电荷，具有更高的生物相容性，更易与药物结合，从而提高其诊断潜力。当 pH 从 8.84 变为 6.35 时，配合物周围的磷酸基团质子化，使每个 Gd3+离子的纵向弛豫率从7.91 L/(mmol·s) 增加到 9.65 L/(mmol·s)，平均纵向弛豫率（在每个分子的基础上减慢分子转动时间）也从348 L/(mmol·s) 增加到 425 L/(mmol·s)，且其弛豫率比值 R2/R1与 pH 值呈线性相关，因此，我们期待通过测定 R2/R1的比值来确定肿瘤的 pH 值。

NP-DO3A NP-DO3AM GdDOTA-4AMP-F

Ln = Gd(III)MRI report (GdDOTA-4AmP5-)44-G5

Ho(III)SPECT tracer

图 10 pH 敏感造影剂

4 温度敏感造影剂

热敏脂质体（thermosensitive liposome，TSL）是一种常用的靶向抗肿瘤药物载体，与热疗联合应用时可使肿瘤药物选择性地蓄积在肿瘤部位，增加对肿瘤细胞的杀伤作用，降低毒副作用，实现局部化疗，同时载入 MRI 造影剂，可用于体内温控药物传递过程的 MRI 监测。de Smet 等[28]开发了一种新型脂质体类温度敏感造影剂，是将一种化疗药物阿霉素与 Gd-造影剂[Gd(HPDO3A)(H2O)] 共同载入脂质体内（图 11）。结果显示，在体内正常温度 37 ℃下，载有药物的脂质体能够稳定存在，当温度升高到 41 ~ 42 ℃时，脂质体内的阿霉素与[Gd(HPDO3A)(H2O)] 迅速释放，提高了造影剂的水分子交换速率，降低 T1 弛豫时间，从而在特定靶部位发挥药效。这种结合化疗药物与造影剂的热敏脂质体将作为一个重要工具用于监测和控制体内药物释放过程，具有良好的应用前景。

阿霉素 [Gd(HPDO3A)(H2O)]

刘瑞清等[29]研发了一种对温度和 pH 敏感的多功能高分子 Gd-造影剂 TPRPP，以N-异丙基丙烯酰胺为温度敏感单体，甲基丙烯酸为 pH 敏感单体，与三丙烯酸菲洛啉钆进行无皂乳液聚合。研究表明，TPRPP 的粒径易受温度或 pH 值的影响，有较好的温度和 pH 敏感性；其横向弛豫率约为 11.3 L/(mmol·s)，为临床造影剂 Magnevist 的 2.6 倍，在肝和脾中具有明显的成像增强。TPRPP 以其低细胞毒性、高稳定性和较高的弛豫率成为一种潜在的多功能 MRI 诊断试剂，为今后合成多功能 MRI 造影剂提供了新的选择。

5 其他生物敏感造影剂

除上述酶、金属离子、pH、温度敏感造影剂，其他生物小分子如氧、葡萄糖、一氧化氮等也能用来作为响应信号开发出生物敏感造影剂。缺氧发生在各种疾病状态中，如癌症、缺血、急性和慢性血管性疾病。Iwaki 等[30]设计合成出第一类带有硝基苯磺酰胺基团的缺氧敏感造影剂 SAGds（图 12），如 4NO22MeOSAGd。大鼠肝微粒体在缺氧条件下，4NO22MeOSAGd中的硝基可选择性还原为胺，芳基磺酰胺基团 pKa 值发生变化，水的交换速率增大，弛豫率增加到原来的 1.8 倍。4NO22MeOSAGd 是第一个1H-MRI造影剂，可在生理条件下选择性地检测缺氧。此外，研究者还开发了与葡萄糖结合后化学交换速率会发生改变[31]，或与 N-亚硝基中间体（一氧化氮氧化态）结合后酰胺和氨基质子会发生转变[32-33]的可逆响应顺磁性化学交换饱和转移（PARACEST）MRI 造影剂，为体内葡萄糖和一氧化氮分子的成像检测提供了新的方向。

4NO22MeOSAGd 4NH22MeOSAGd

6 结语

近年来，随着 MRI 新技术的迅速发展及其在临床医学上的广泛应用，智能 MRI 造影剂在提高生物成像的敏感性和分辨率方面发挥着极为重要的作用，有望满足不同的生物医学研究和临床需求。综上所述，基于生物敏感的 MRI 造影剂的研究目前还是一个新兴的领域，为分子影像医学带来了很大的突破，为疾病的诊断治疗提供了更好的平台技术，但理想的生物敏感造影剂不仅仅靠化学领域合成，还需对其进行跨学科多领域更深入系统的研究。此外，在对各种复杂疾病进行诊断时仅靠 MRI 难以提供更全面的信息，需要将其与其他成像技术，如 CT 成像、超声成像等联合运用。生物敏感 MRI 造影剂的研究仍面临着巨大的挑战，在医学诊断领域仍有广阔的应用前景。开发具有靶向性、弛豫率高、用药量少、毒副作用小、成本低且对生理生化信号有更高敏感程度的多功能新一代 MRI 造影剂成为今后研究的主要方向。

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协和青年科研基金（3332016056）

250022 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院（刘云）；250062 济南，山东省医学科学院药物研究所（刘云、姚庆强）；100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所（张蕾磊、胡海宇）

姚庆强，Email：yao_imm@163.com；胡海宇，Email：haiyu.hu@imm.ac.cn

2016-09-02

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.06.011