小尺寸低聚壳聚糖/丹参酮IIA纳米载药体系

李 虹, 杜立波, 张 晗, 肇玉明, 刘 扬

(1. 中国科学院化学研究所, 北京 100190; 2. 首都医科大学基础医学院, 北京 100069;3. 中国科学院大学, 北京 100049)



［研究快报］

小尺寸低聚壳聚糖/丹参酮IIA纳米载药体系

李 虹1,3, 杜立波1, 张 晗1, 肇玉明2, 刘 扬1,3

(1. 中国科学院化学研究所, 北京 100190; 2. 首都医科大学基础医学院, 北京 100069;3. 中国科学院大学, 北京 100049)

小尺寸壳聚糖纳米胶束; 丹参酮IIA; 神经保护剂; 难溶药物转运

纳米载药系统以其独特的化学性质已广泛应用于小分子药物转运, 并已有相关的临床实例报道[1～6]. 壳聚糖(CS)因其所特有的无生物毒性、 易生物降解和良好生物相容性等优点而备受关注[7～16]. 由于传统方法制备的壳聚糖纳米颗粒粒径高达数百纳米, 使其生物利用度低, 限制了其更广泛应用. 我们在前期工作中发现: 一种无残留合成方法可以制备粒径在50～80 nm的小尺寸低聚壳聚糖纳米载体, 并可携带药物高效穿透细胞膜, 显著提高药效[17,18]. 但该载体尚未能解决难溶小分子药物[如抗中风中药丹参酮IIA(TSIIA)]的有效包载[19]. 考虑到D-α-生育酚琥珀酸酯(TPS)具有优良的亲脂性, 对许多难溶性药物都是一种优良的溶剂[20], 并且结构与难溶性药物具有相似相容的特征, 本文设计并制备了一种TPS修饰的低聚壳聚糖两亲性聚合物胶束体系, 并以TSIIA为难溶药物检验了其载药能力、 生物安全性与神经细胞摄入能力.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器 TPS, Sigma-Aldrich 公司; 壳聚糖、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC, 纯度98.5%)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS, 纯度98.5%)和二甲基亚砜(DMSO, 纯度96%), 国药集团化学试剂有限公司. 瑞士Bruker公司AVANCE400型核磁共振波谱仪(1H NMR)与TENSOR-27型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR); 日本日立公司S-4800型扫描电子显微镜(SEM); 日本岛津公司UV-2450型紫外-可见分光光度计(UV-Vis).

1.2 实验过程 依据实验室前期报道[17], 壳聚糖经氧化降解后再经羟乙基化获得分子量约为4000的水溶性低聚CS, 然后通过EDC/NHS反应接枝上TPS, 反应过程如Scheme 1所示. 将质量分数为2%CS的DMSO溶液用EDC/NHS(摩尔比为1.2∶1)活化2 h, 加入TPS的DMSO溶液, 于45 ℃搅拌2 h, 所得溶液透析2 d后冻干, 产物CS-g-TPS经MALDI-TOF质谱分析其分子量不大于4000(见本文支持信息, 图S1). 将上述CS-g-TPS粉末溶于水, 再少量多次加入TSIIA药物粉末后即刻超声振荡, 得初级载药纳米颗粒, 然后加入戊二醛进行交联后再羟乙基化, 获得纳米载药系统TSIIA@CS-g-TPS.

用噻唑蓝(MTT)方法评价纳米细胞毒性, 纳米载体细胞摄入的荧光成像实验见本文支持信息.

2 结果与讨论

2.1 载药壳聚糖纳米颗粒的表征与纳米自组装 低聚CS和CS-g-TPS的1H NMR谱见本文支持信息. 根据TPS末端甲基质子氢与CS特征峰积分面积比计算出取代度约为1.4%. 对比CS和 CS-g-TPS 的红外光谱, 可看出TPS接枝到 CS 骨架上. FTIR与1H NMR结果可互相印证接枝成功.

采用紫外-可见分光光度法测得载体对TSIIA包载量为14.1%, 包封率为100%. TSIIA分子的能量结构决定其熔点高且极难溶于水. 但TPS亲脂性强且生物相容性好, 与TSIIA药物结构相似, 因此本文设计并制备TPS连接的聚合物包载TSIIA.

Fig.1 In vitro cytotoxicity of CS-g-TPS(A) and TSIIA@CS-g-TPS(B) in primary neural cell

Fig.2 Confocal images of SH-SY5Y cells incubated with FITC-labeled TSIIA@CS-g-TPS (A, A′) Fluorescence; (B, B′) bright-field; (C, C′) overlay; (A—C) 0.5 h; (A′—C′) 3 h.

2.2 壳聚糖纳米载药体系的细胞毒性检验与细胞摄入性能分析 中枢神经系统作为机体的重要器官, 在药物干预时, 需要高效且低毒的转运系统. TSIIA作为神经保护类抗中风药物, 载药体系的生物安全性和细胞跨膜特性至关重要, 对细胞毒性的要求也远高于抗癌药物载体. 因此, 本文采用最接近活体效果的小鼠原代神经元来检验载体体系的细胞毒性, 结果见图1. 可见载药体系TSIIA@CS-g-TPS[图1(A)] 还是空载体CS-g-TPS[图1(B)]均未导致明显的细胞毒性. 图1(A)中的MTT结果甚至显示当包载药物后细胞存活率可超过100%, 展现出药物营养细胞的效果.

纳米载药体系通常是以内吞方式被高效摄入靶细胞[17,18,21,22], 因此其药效与细胞内吞速度密切相关. 为了验证本文中的小尺寸低聚壳聚糖纳米载体可高效通透细胞膜的假设, 采用激光共聚焦显微镜监测了用FITC荧光标记的TSIIA@CS-g-TPS通透神经细胞株SH-SY5Y的状况, 结果示于图2. 当孵育3 h后, 在细胞质内清晰可见摄入大量带荧光标记的TSIIA@CS-g-TPS. 其细胞摄入效率甚至比未接枝TPS的壳聚糖载体更高(前文中神经细胞显著摄入的时间为6～12 h)[17]. 结果表明本文的新载药体系有望在中风等神经损伤相关疾病的治疗方面展示出更大的应用潜力.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20160288.

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(Ed.: D, Z)

New Tanshinone IIA Delivery System Using Chitosan Nanomicelles of Small Size†

† Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.31570856, 31571020), the Beijing Natural Science Foundation of China(No.5152005) and the 2016 Scientific Research Project of Beijing Educational Committee of China(No.KM201610025003).

LI Hong1,3, DU Libo1, ZHANG Han1, ZHAO Yuming2*, LIU Yang1,3*

(1.InstituteofChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100190,China;2.SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;3.UniversityofChineseAcademyofScience,Beijing100049,China)

It is still a great challenge to design and synthesize ultra-small chitosan nanoparticles for encapsulating highly hydrophobic neuroprotectants, such as anti-stroke drug tanshinone IIA. To address the issue, a new amphiphilic polymeric micelle system(i.e. CS-g-TPS) was synthesized by covalent linking ofD-α-tocopherol succinic acid ester with hydroxylethyl-chitosan in a green and effective approach. The results showed that the obtained CS-g-TPS can be self-assembled into ultra-small nanoparticles by hydrophilic-hydrophobic interaction in aqueous solution, which can be effectively loaded with tanshinone IIA. The particle size and morphology were characterized by scanning electron microscopy(SEM) and dynamic light scattering(DLS), respectively. Bioassays of cell viability and drug uptake further revealed that the CS-g-TPS/tanshinone IIA delivery system could achieve excellentinvitrobiocompatibility, as well as high cellular uptake efficiency. It indicated that CS-g-TPS might be a promising drug delivery system for water insoluble neuroprotectant with the characteristics of high biosafety.

Chitosan nanomicelles of small size; Tanshinone IIA; Neuroprotectant; Delivery for poorly soluble drugs

2016-04-24.

日期: 2016-06-16.

国家自然科学基金(批准号: 31570856, 31571020)、 北京市自然科学基金(批准号: 5152005)和2016年北京市教育委员会科技计划一般项目基金(批准号: KM201610025003)资助.

O636

A

联系人简介:刘 扬, 男, 博士, 研究员, 主要从事纳米生物学与自由基生物学研究. E-mail: yliu@iccas.ac.cn

肇玉明, 女, 博士, 副教授, 主要从事神经药理学研究. E-mail: yumingzhao@ccmu.edu.cn