吡那地尔对术后持续性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1释放的影响

朱翔，曹苏，秦毅彬，佘庆，丁晶晶，杨建平

(1.苏州大学附属第一医院 麻醉科，江苏 苏州 215006；2.南通大学附属医院 麻醉科，江苏 南通 226001)



·论 著·

吡那地尔对术后持续性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1释放的影响

朱翔1，曹苏2，秦毅彬2，佘庆2，丁晶晶2，杨建平1

(1.苏州大学附属第一医院 麻醉科，江苏 苏州 215006；2.南通大学附属医院 麻醉科，江苏 南通 226001)

目的：观察吡那地尔(pinacidil)对术后持续性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1释放的影响。方法:随机将35只大鼠分为正常组(Control组)、假手术组(Sham组)、切割+牵拉皮肤肌肉组(SMIR组)、溶剂+SMIR组(Vehicle组)、吡那地尔+SMIR(Pina组)、吡那地尔+格列苯脲+SMIR组(Pina+Gli组)、格列苯脲+SMIR组(Gli组)等7组。检测各组机械刺激缩足反射痛阈值(MWT)，Western blot/ELISA法检测脊髓JNK/MCP-1蛋白表达。结果：(1) 与Sham组相比，SMIR组MWT在术后3 d开始降低(P<0.01)，并持续21 d(P<0.001)以上；(2) SMIR术后持续显著上调脊髓JNK/MCP-1的表达(P<0.01)；(3) 鞘内注射吡那地尔显著下调术后SMIR诱导的脊髓JNK/MCP-1表达(P<0.01)和上调MWT(P<0.01)，格列苯脲能阻断吡那地尔所引起的上述变化(P<0.05)。结论：吡那地尔能抑制切割及牵拉皮肤肌肉所致的术后持续性疼痛，其机制可能与抑制JNK/MCP-1的上调有关。

术后持续性疼痛；吡那地尔；JNK/MCP-1；脊髓；大鼠

临床上10%～50%的患者随着术后炎症的消退或者组织痊愈，存在术后慢性持续性疼痛[1]，因此术后急性痛转为慢性痛机制的研究成为重要课题之一。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium,KATP)广泛分布在中枢神经系统，调节细胞膜兴奋性和神经递质的释放，对神经系统起到保护作用，激活KATP可介导镇痛作用[2-3]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)在脊髓星状胶质细胞持续激活可产生中枢敏化，JNK/MCP-1的活化是神经病理性痛形成的关键，抑制其活化可减轻痛觉过敏[4]。本研究观察KATP开放剂吡那地尔对术后持续性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1变化的影响，探讨激活KATP产生镇痛的作用及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究经南通大学实验动物保护和使用伦理委员会批准。SPF级SD雄性大鼠35只南通大学实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2008-0010，鼠龄7～9周，质量200～250 g。

1.2 主要仪器、药品、材料

0.25%二甲基亚砜、多聚甲醛、吡那地尔、格列苯脲(美国Sigma公司)，胰蛋白酶(中国华美生物工程公司)，异氟烷(英国RHODIA公司)，von Frey纤毛刺激仪(美国North Coast Medical公司)，电泳及转膜系统(美国Bio-Rad Laboratories公司)，荧光实时定量PCR仪器(美国Eppendorf公司)，凝胶成像系统(中国北京原平皓生物技术有限公司)，动物麻醉机(美国A.M.BICKFORD INC公司)，ELX8W酶联免疫检测仪(美国BioTek公司)，电动匀浆器(美国Biospec Products INC公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及处理 随机将大鼠分7组，即正常组(Control组)、假手术组(Sham组)、切割+牵拉皮肤肌肉组(SMIR组)、溶剂+SMIR组(Vehicle组)、吡那地尔+SMIR(Pina组)、吡那地尔+格列苯脲+SMIR组(Pina+Gli组)、格列苯脲+SMIR组(Gli组)，每组5只。正常组不做任何处理；Sham组仅切割皮肤、肌肉1 h；SMIR组切割+牵拉皮肤、肌肉1 h；Vehicle组在SMIR术后7 d鞘内注射等体积0.25%二甲基亚砜；Pina组在SMIR术后7 d鞘内注射4 μg·kg-1或20 μg·kg-1吡那地尔；Pina+Gli组在SMIR术后7 d鞘内注射20 μg·kg-1吡那地尔+20 μg·kg-1格列苯脲；Gli组在SMIR术后7 d鞘内注射20 μg·kg-1格列苯脲。各组动物常规饲养。

1.3.2 大鼠SMIR模型的建立 按Flatters法[5]建立大鼠SMIR模型。麻醉后仰卧大鼠，在大腿中部隐静脉内侧3～4 mm处做2 cm切口，暴露肌肉，然后在浅层肌肉(股薄肌)处做一长约8 mm切口，钝性分离肌肉，撑开器拉开至2 cm，1 h后缝合皮肤肌肉，见图1。

图1 大鼠SMIR模型手术示意图

1.3.3 行为学检测 测定各组术前及术后机械刺激缩足反射痛阈值(MWT)，测试之前各组大鼠适应环境3 d。测试时大鼠放置有机玻璃的金属筛网上适应30 mim，刚度呈对数递増(1.4～26 g)的von Frey纤毛刺激仪垂直刺激术侧后肢爪底，持续时间≤4 s,出现缩爪、甩爪、舔爪等现象视为阳性反应，否则为阴性，记录5次结果，有2次或2次以上反应则为机械性触诱发痛。若出现小于2次阳性反应，则使用高一级别力度刺激，若2次或以上阳性反应则给予低一级别力度刺激。连续实施刺激，直到出现1次阳性和阴性反应骑跨，记录数值，然后再测量5次，每次间隔30 s。

1.3.4 脊髓鞘内注射药物 应用异氟烷吸入麻醉，备皮消毒，在第3、4或第4、5腰椎棘突间使用29gauge(B-D公司)注射针，注射20 μl的药物到大鼠蛛网膜下隙，穿刺是否成功主要观察大鼠在穿刺时尾巴突然出现颤动或向侧方甩动。

1.3.5 ELISA法 术后第10天鞘内注药并测定机械痛阈后，腹腔注射4%水合氯醛(400 mg·kg-1)深麻醉大鼠，取左侧L 3～5脊髓节段，加入裂解液，冰上充分匀浆，离心后收集上清液。按照每孔200 mg的量与ddH2O配成100 μl总体积，稀释10倍后按照试剂盒说明书操作，检测各组脊髓组织中MCP-1的含量。根据标准曲线计算实际质量浓度，以ng·L-1表示。

1.3.6 Western blot 腹腔注射10%水合氯醛400～500 mg·kg-1麻醉，取脊髓腰膨大L 3～5节段组织，加入蛋白裂解液匀浆，收集细胞裂解液0.2 ml，离心提取总蛋白，蛋白变性，4 ℃保存。每孔上样量含30 μg总蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，电泳后转膜于0.2 μm PVDF膜，以含5%脱脂奶粉的TBST封闭液室温封闭2 h。4 ℃过夜，加入以封闭液稀释的JNK(苏氨酸183/酪氨酸185)(兔，1∶1 000稀释，CST，9251)一抗，4 ℃孵育过夜。用TBST洗10 min 3次，用相应二抗(Bioworld，1∶2 000)室温孵育2 h，漂洗后应用化学发光底物试剂盒在凝胶成像系统中进行检测。使用Image J图像软件对结果进行分析，GAPDH为内参照，各组目的蛋白与各组内参蛋白灰度值的比值表示各组目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析，所有计量资料以均数±标准误表示，组间的比较采取单因素方差分析(One way ANOVA)，两两间的比较采用t检验(Student’sttest)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SMIR诱导快速机械触诱发痛

SMIR术后，大鼠手术侧后爪的MWT从术后3 d开始下降(P<0.01)，并维持至21 d(P<0.001)。SMIR组的MWT在所有时间点上显著低于假手术组(P<0.001)。见图2。

与Sham组比较，aP<0.01; bP<0.001。BL.术前基础值

图2 SMIR诱导的大鼠机械痛敏时程的变化

Fig 2 Time course of SMIR-induced mechanical allodynia in rats

2.2 SMIR持续上调脊髓P-JNK和MCP-1的表达

与正常组比较，SMIR组术后3、7、14 d脊髓中P-JNK和MCP-1的表达持续增高(P<0.05、0.01、0.001)。见图3。

2.3 鞘内注射吡那地尔上调MWT

SMIR术后7 d，鞘内注射吡那地尔呈剂量依赖性显著拮抗由SMIR诱导MWT下降，作用时间持续2 h以上，但吡那地尔的镇痛作用可被格列本脲拮抗(P<0.05)，而溶剂组无显著影响，见图4。

与Control组比较，aP<0.05; bP<0.01; cP<0.001

图3 SMIR持续上调脊髓P-JNK/MCP-1的表达

Fig 3 SMIR induced a persistent p-JNK/MCP-1 increase in the spinal cord

与Vehicle组比较，aP<0.05,bP<0.01; 与Pina 20 μg组比较，cP<0.05。BL.术前基础值

图4 鞘内注射吡那地尔上调MWT

Fig 4 Intrathecal administration of Pina inhibits mechanical allodynia after SMIR

2.4 鞘内注射吡那地尔下调P-JNK和MCP-1的表达

与Control组相比，Vehicle组P-JNK和MCP-1的表达显著增加(P<0.01或0.001)，Pina组无显著差异；与Vehicle组相比，Pina组P-JNK和MCP-1的表达显著降低(P<0.01)。见图5。

与Control组比较，aP<0.01,bP<0.01;与Vehicle组比较，cP<0.01

图5 鞘内注射吡那地尔下调P-JNK/MCP-1的表达

Fig 5 Intrathecal administration of Pina downregulates P-JNK/MCP-1 activation after SMIR

3 讨 论

本研究根据文献建立大鼠SMIR术后持续性疼痛模型，能较长时间牵拉皮肤和肌肉组织而不损伤其周围外周神经，从而能模拟切口周围炎性微环境的特点和术后持续性疼痛过程，术后主要表现为持续机械痛觉超敏，术后MWT呈时间依赖性显著下降(图2)，表明大鼠术后持续性疼痛模型制备成功。

离子通道在疼痛信号的产生和传导中起重要作用[6]。近来一些实验研究发现，K+通道的一个亚族KATP离子通道在疼痛的发生和发展过程中也起着积极和关键的作用。KATP通道广泛分布在中枢神经元系统，其作用主要是调节细胞膜兴奋性和神经递质释放，同时还起着神经保护作用。它的活化通过调节细胞电活动[7]、增加ATP的合成[8]、减少自由基[9]、防止Ca2+超载和维持线粒体功能[10]等多种机制改善微环境参与预适应保护。超敏疼痛的大鼠KATP开放被抑制[6，11]。但KATP通道的镇痛作用机制的研究目前还很少。

JNK家族是促分裂原活化蛋白激酶超家族成员之一，JNK的激活可诱导脊髓产生多种炎症介质的表达和释放，如一氧化氮合酶、环氧合酶等，JNK的激活也能诱导细胞因子和趋化因子表达和释放，从而产生中枢敏化[2]。JNK是MAPK信号通路中的关键亚族，在疼痛的发生和发展中起着重要的作用。在SNL模型中，磷酸化的JNK(活性形式)已被证明在细胞内信号传导中起关键作用。JNK的活化又可使脊髓MCP-1大量表达，从而活化胶质细胞，MCP-1通过趋化因子受体2(CC chemokinereceptor2，CCR2)的介导参与慢性疼痛的形成和维持[12-13]。在本研究中，SMIR持续上调术后脊髓JNK/MCP-1的表达(图3)，激活脊髄JNK/MCP-1信号产生中枢敏化，从而参与疼痛。SMIR术后7 d鞘内注射KATP开放剂吡那地尓后，显著抑制脊髓JNK/MCP-1的表达激活(图5)，下调机械性触诱发痛(图4)，而吡那地尔的阻滞剂格列苯脲能够阻滞这一镇痛作用，表明激活KATP通过抑制脊髄JNK/MCP-1信号活性产生镇痛作用。

本研究表明，KATP通道开放剂是减轻术后疼痛的有效方法。这种影响可能是通过JNK/MCP-1通路的激活介导的，作为KATP通道可能在神经元和胶质细胞不同的功能作用，需要进一步的研究来探讨。总之，KATP通道可作为术后疼痛治疗的有效靶点。

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Effect of pinacidil on JNK/MCP-1 expression in spinal cord of a rat model of persistent postoperative pain

ZHU Xiang1，CAO Su2，QIN Yi-bin2，SHE Qing2，DING Jing-jing2，YANG Jian-ping1

(1.DepartmentofAnesthesiology，theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215006，China;2.DepartmentofAnesthesiology，AffiliatedHospitalofNantongUniversity，Nantong226001，China)

Objective：To observe the effect of pinacidil on JNK/MCP-1 expression in spinal cord of a rat model of persistent postoperative pain.Methods：SD rats were divided into 7 groups randomly:control group(Control group), sham operation group (Sham group), skin/muscle incision and retraction group (SMIR group), vehicle +SMIR group (Vehicle group), pinacidil+SMIR (Pina group), pinacidil+ glibenclamide +SMIR group (Pina+Gli group) and glibenclamide +SMIR group (Gli group).The mechanical withdrawal threshold (MWT) of the left hind paw of rats in different group was measured at different time points after the surgery.Western blot/ELISA were used to measure the protein expression level of JNK/MCP-1.Results：(1) Compared with Sham group，MWT in SMIR group was reduced significantly from 3 d after the operation (P<0.01)，and lasted for more than 21 d (P<0.001).(2) The protein expression of JNK/MCP-1 were significantly increased after SMIR as compared with the control group(P<0.01).(3) Intrathecal injection of pinacidil attenuated the express of JNK/MCP-1 in the spinal cord (P<0.01) and up-regulated the MWT (P<0.01)，which could be blocked by glibenclamide (P<0.05).Conclusion：Pinacidil inhibits the persistent postoperative pain caused by SMIR.The mechanisms may be partly due to the inhibition of JNK/MCP-1 upregulation．

persistent postoperative pain; pinacidil; JNK/MCP-1; spinal cord; rats

2016-03-29

2016-05-20

国家自然科学基金资助项目(81400915)；南通大学附属医院转化医学基地科研项目(TDFzh2014013)

朱翔(1978-)，男，江苏南通人，在读医学博士研究生。E-mail:bobofly8850@sina.com

杨建平 E-mail:szyangjp@126.com

朱翔，曹苏，秦毅彬，等.吡那地尔对术后持续性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1释放的影响[J].东南大学学报：医学版，2016，35(5)：678-682.

R-332; R972.4

A

1671-6264(2016)05-0678-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．007