抗原致敏DC联合CIK治疗对肾癌术后患者免疫功能的影响*

邬宇飞 庄志祥

(1.张家港澳洋医院有限公司三兴分院,江苏 张家港 215624;2.苏州大学附属第二医院肿瘤科，江苏 苏州 215004)



抗原致敏DC联合CIK治疗对肾癌术后患者免疫功能的影响*

邬宇飞1庄志祥2

(1.张家港澳洋医院有限公司三兴分院,江苏 张家港 215624;2.苏州大学附属第二医院肿瘤科，江苏 苏州 215004)

目的 研究抗原致敏DC联合CIK治疗对肾癌术后患者免疫功能的影响。方法 选取2012年3月至2014年4月苏州大学附属第二医院收治的42例肾癌术后患者(Ⅰ～Ⅲ期)，男25例，女17例。中位年龄57(28～73)岁。应用免疫荧光法测定患者接受联合生物治疗前1周和治疗后1周的细胞免疫功能，并比较其变化。治疗后1周进行迟发型过敏反应(DTH)试验，观察阳性率。 结果 应用联合生物治疗1周后，患者的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD56+、CD4+/CD8+比值升高，与治疗前比较差异有统计学意义(P﹤0.05)；外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ水平显著升高(P﹤0.05)，机体对肿瘤抗原的特异性DTH反应明显增强，迟发型过敏反应(DTH)阳性率达73.80%(31/42)，无严重不良反应。结论 肾癌术后应用抗原致敏DC+CIK联合治疗能有效提高患者的细胞免疫功能，改善免疫应答，可提高患者的生存获益，是安全有效的。

肾癌；肿瘤抗原负载的树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞；生物治疗

肾细胞癌(renal cell cancer，RCC)在我国泌尿生殖系统肿瘤中占第二位，发病率仅次于膀胱癌，占成人恶性肿瘤的2%～3%，可见于各个年龄段，高发年龄在50～70岁，男女比为2∶1[1]。早期肾癌主要以手术治疗为主，进展期肾癌以化疗及生物靶向治疗为主，由于肾癌细胞内存在多耐药基因，传统化疗的有效率不高。由于肾癌是一种免疫原性较强的肿瘤，因此免疫治疗成为肾癌术后重要的辅助治疗方法[2]。肿瘤疫苗主要是通过激活抗肿瘤的特异性或相关性抗原来激发肿瘤患者的特异性免疫反应，是目前乃至将来肾癌生物免疫治疗的一个重要方向。树突状细胞(dendritic cell，DC)是最有效的专职抗原提呈细胞，能诱发肿瘤宿主对特异性抗原的免疫应答，提高肿瘤宿主免疫效应细胞的细胞毒活性，DC疫苗是利用树突状细胞(DC)能递呈抗原的特点，将肿瘤相关抗原与DC融合制成肿瘤疫苗再回输到患者体内，从而激发特异性抗瘤免疫应答。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)杀瘤活性强、杀瘤谱广等特点，能在体外被诱导并大量增殖。本研究采用负载肿瘤细胞株抗原的DC联合CIK治疗42例肾癌术后患者，监测细胞免疫治疗后患者免疫功能的变化，观察迟发型过敏反应(DTH)并评估其治疗安全性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2012年3月至2014年4月苏州大学附属第二医院收治的42例肾癌术后患者(Ⅰ～Ⅲ期)，男25例，女17例。中位年龄57(28～73)岁。入选患者均经手术后病理学确诊为肾透明细胞癌，其中Ⅰ期23例，Ⅱ期17例，Ⅲ期2例，体力状况评估均为0～2，预计生存期>6个月，心电图正常，肝肾功能均正常，骨髓功能正常，治疗前未接受过放化疗等影响免疫功能的治疗。

1.2 主要试剂与设备 RPMI 1640培养基、100x非必须氨基酸、新生牛血清(灭活、分装)购自WISENT公司，rh-GM-CSF、IL-4、IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗与IL-1β、PEG-2购自R&D公司，淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司，鼠抗人FITC-CD3抗体、PE-CD4抗体、PerCP-CD8抗体、APC-CD56单抗均购自美国BD公司。内毒素检测试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司，细胞因子检测试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司。流式细胞仪(BD FACSCALIBUR)，超净工作台(SW-CJ-1FD)，倒置显微镜(重庆广电XDS-1B)，CO2培养箱(Thermo 3111)，肾癌786-0细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 肾癌细胞抗原的制备 将肾癌786-0细胞株放入含5%正常人AB血清的RPMI 1640培养基中悬浮，放入42℃的细胞培养箱中热休克3 h，后加入10 μg/ml桦脂酸，再放入37℃、5% CO2培养箱中36～48 h后获得的细胞作为抗原。

1.3.2 DC的体外培养及抗原负载 采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI 1640培养液调整PBMC浓度为3×106/ml，将细胞接种于6孔培养板，置37℃、5% CO2培养箱孵育90 min后吸取未贴壁细胞(PBL)，于孔中加入DC诱导培养液(含5%自体血浆、100 ng/ml rh-GM-CSF、50 ng/ml rh-IL-4)，置37℃、5% CO2培养箱中诱导，第3天进行1/3换液，同时补充细胞因子。第5天收获未成熟DC，肾细胞癌抗原与未成熟DC以1∶5的比例混合，进行抗原负载，第6天加入终质量密度为10 ng/ml IL-1β、10 μg/ml PGE-2、20 ng/ml TNF-α诱导培养，24 h后收获成熟DC，留样行内毒素、支原体、细菌检测，准备用于临床注射。

1.3.3 CIK细胞的体外培养 从患者的外周血中分离出单个核细胞，经淋巴细胞分离液分离后用生理盐水洗涤3次，调整细胞密度为2×106/ml，置入含IFN-γ 2000 U/ml和10%AB血清的RPMI 1640培养液中培养，24 h后接种于包被有抗CD3单抗的培养瓶内，同时加入IL-2(2000 U/ml)继续培养。每3天观察并换液1次，10～14天做支原体等培养，结果阴性后收集细胞，洗涤后制备成细胞悬液用于临床回输治疗。

1.3.4 DC和CIK细胞质量控制 制备和细胞培养过程中严格遵守各项操作规程，全程无菌操作，每次治疗前24小时，对DC和CIK细胞取样，按照2010版《中华人民共和国药典》方法进行细胞活率、内毒素和细菌、霉菌等检测，细胞活率大于95%、检测无污染后方可收获回输。

1.3.5 治疗方法 患者术后1月进行负载细胞株抗原的DC联合CIK细胞治疗，一个疗程共回输5次，共2个疗程，疗程间隔1个月。具体方案：采集细胞后第7、11天皮内注射DC细胞液，DC注射前、中与后测量患者生命体征；采用18 G贝朗浅静脉留置针(配BD血气针筒)，注射部位分别为双侧腹股沟区，每侧各1 ml，总细胞数为3×107～10×107；第7、8、9、10、11天静脉回输CIK总细胞数为2×109～15×109，治疗前所有接受治疗的患者均签署知情同意书。

1.3.6 免疫测定方法和不良反应监测 流式细胞仪检测DC-CIK对淋巴细胞亚群的影响，患者接受联合生物治疗前1周和治疗后1周采集患者外周血检测患者的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD4+/CD8+比值，酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平。

1.3.7 迟发型过敏试验(DTH) 用肿瘤抗原做皮肤迟发型过敏反应试验(DTH)，DC免疫治疗后5～7天内进行，皮内注射：分别于两上肢前臂内侧行皮内注射，一侧注射抗原(同DC负载抗原)，另一侧注射生理盐水，每侧推注0.2 ml，注射完毕后轻轻按压进针部位，以减少细胞液外漏。做好两侧标记。注射结束后嘱患者休息30 min，无不适反应方可离开。注射后48～72 h内观察注射部位有无红肿结节，并测量结节直径大小，作相应记录，直径大于5 mm者为DTH试验阳性。

2 结 果

2.1DC及CIK细胞培养前后细胞增殖情况 倒置显微镜下可见细胞呈集落样生长，细胞数量培养前明显增多，DC细胞表面出现典型的树突状伪足，体积明显增大，CIK细胞呈圆形，透亮，胞体饱满(图1～4)。

图1 诱导前DC细胞形态(100×)

图2 诱导后DC细胞形态(100×)

图3 诱导前CIK细胞形态(100×)

图4 诱导后CIK细胞形态(100×)

2.2 治疗前后外周血淋巴细胞亚群变化 监测患者接受细胞免疫治疗前后淋巴细胞亚群的变化(表1)，患者的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD56+、CD4+/CD8+比值升高，与治疗前比较差异有统计学意义(P﹤0.05)，可以看出治疗后患者的免疫功能得到明显的改善(表1)。

表1 患者治疗前后外周血淋巴细胞亚群的变化

2.3 治疗后细胞因子的变化 治疗前后患者外周血细胞因子变化见表2，外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ水平显著升高(P﹤0.05)，IL-10、TNF-α水平无明显变化。

表2 患者治疗前后外周血细胞因子的变化

2.4 皮肤迟发型过敏反应试验(DTH) 42例患者均进行了迟发型过敏反应(DTH)试验，第一疗程后有25例阳性，阳性率达59.52%；第二疗程后有31例阳性，阳性率达73.80%。

2.5 治疗后患者的不良反应 治疗中有2例患者第1天出现38～39℃发热，无畏寒，经对症处理后均得到缓解，无其他不良反应。治疗前后监测血常规、肝肾功能、电解质均无明显异常。

2.6 随访情况 所有患者都进行了随访，随访时间大于2个月，平均随访时间11.6个月，1例出现肺部转移，大部分患者生活质量良好，其中17例患者又追加生物治疗1～3疗程。

3 讨 论

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，以透明细胞癌最为常见，资料显示肾癌术后仍有30%～40%的患者会发生复发或远处转移，术后的5年生存率为35%～40%[3]。对放化疗不敏感，研究表明[4-5]，RCC与患者的免疫功能缺陷有着密切关系，肾癌根治术后辅以生物免疫治疗，可激发机抗肿瘤免疫反应，消灭潜在转移病灶，防止复发，提高患者的生存率。目前用于治疗肿瘤的免疫活性细胞主要有LAK细胞、TIL细胞、NK细胞、CD3AK细胞、CIK细胞等，DC是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞(APC)，能分泌Th1类细胞因子如IL-2、IL-12，诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ，在肿瘤免疫中发挥着至关重要的作用。CIK是一种非MHC限制性的高效细胞毒性T细胞，兼具有T细胞的强大抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点[6]。文献[7-9]报道，DC-CIK联合治疗对免疫细胞的增殖能力、对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌的能力均优于单用CIK细胞。肾癌是抗原相关性肿瘤，比较明确的有生长因子受体EGFR、HER2/neu、G250和p53等。本研究以42例Ⅰ～Ⅲ期肾癌术后患者为研究对象，采用热休克凋亡肾细胞癌抗原负载DC联合CIK治疗来分析观察患者治疗前后免疫功能的影响。本研究显示，DC和CIK细胞在体外培养后快速增殖，回输治疗后患者外周血的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD56+、CD4+/CD8+比值升高，外周血细胞因子中IL-2、IL-12、IFN-γ水平显著升高(P﹤0.05)，治疗后DTH试验阳性率达到73.80%，说明抗原负载DC联合CIK治疗后有效地激发了患者的免疫应答，增强了患者的免疫功能。肿瘤疫苗是通过给机体注入具有抗原活性的肿瘤疫苗，刺激机体产生特异性免疫反应，达到治疗肿瘤、预防肿瘤转移和复发的目的[10]。有研究[11]报道负载抗原多肽的DC具有激发特异性CTLs的能力，研究中部分患者抗原特异性IFN-γ+CD8+T细胞比例明显升高，与DTH试验为阳性率呈正相关，本研究42例患者中有31例患者DTH阳性，有效地激发了患者的特异性免疫应答，关于肾癌抗原负载DC治疗后DTH试验的研究报道较少，本研究显示患者免疫功能得到加强，理论上可以降低肾癌术后的复发率，延长患者生存期，随访中有一例进展，其余稳定，但由于部分病例随访时间短，且没有设置横向比较组，有待进一步行回顾性研究以评价其临床疗效。关于肾癌术后使用抗原致敏DC-CIK联合治疗后的PFS及OS还需更长时间的随访观察。总之，抗原致敏DC-CIK联合治疗的副反应小，耐受性良好，有望降低肾癌术后的复发率，延长生存期，是安全可行的。

[1] 吴阶平.泌尿外科学[M].济南:山东科学技术出版社,2012:889-917.

[2]SuJR,ZhuDJ,LiangW,etal.Investigationontheindicationofipsilateraladrenalectomyinradicalnephrectomy:ameta-analysis[J].ChineseMedJ,2012,125(21):3885-3890.

[3]NaKY,KimHS,ParkYK,etal.Multifocalrenalcellcarcinomaofdifferenthistologicalsubtypesinautosomaldominantpolycystickidneydisease[J].KoreanJPathol,2012,46(4):382-386.

[4]JakelCE，HauserS，RogenhoferS，etal．Clinicalstudiesapplyingcytokine-inducedkillercellsforthetreatmentofrenalcellcarcinoma[J].ClinDevImmunol,2012: 473245．

[5]MihalyZ，SztupinszkiZ，SurowiakP，etal．Acomprehensiveoverviewoftargetedtherapyinmetastaticrenalcellcarcinoma[J].CurrentCancerDrugTargets，2012，12( 7) : 857-872．

[6]LiR，WangC，LiuL，etal．Autologouscytokine-inducedkillercellimmunotherapyinlungcancer:aphaseⅡclinicalstudy[J].CancerImmunology,Immunotherapy,2012, 61 (11): 2125-2133.

[7]YangL，RenB，LiH，etal．EnhancedantitumoreffectsofDC-activatedCIKstochemotherapytreatmentinasinglecohortofadvancednon-small-celllungcancerpatients[J].CancerImmunologyImmunotherapy,2013,62(1): 65-73．

[8]ZhanHL，GaoX，PuXY，etal．Arandomizedcontrolledtrialofpostoperativetumorlysate-pulseddendriticcellsandcytokine-inducedkillercellsimmunotherapyinpatientswithlocalizedandlocallyadvancedrenalcellcarcinoma[J].ChinMedJ(Engl),2012,125( 21):3771-3777．

[9]RenJ，DiL，SongG，etal．Selectionsofappropriateregimenofhigh-dosechemotherapycombinedwithadoptivecellulartherapywithdendriticandcytokine-inducedkillercellsimprovedprogression-freeandoverallsurvivalinpatientswithmetastaticbreastcancer:reargumentofsuchcontentioustherapeuticpreferences[J].ClinicalandTranslationalOncology, 2013, 15 (10):780-788.

[10]DillmanRO．Cancerimmunotherapy[J]．CancerBiotherRadiopharm，2011，26( 1) : 1-64．

[11] 时伟锋，唐金海.负载自体热休克凋亡癌细胞抗原的DC治疗三阴性乳腺癌的随机对照多中心临床试验[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2014,21(3):237-244.

The effect of immune function of Tumor antigen-loaded dendritic cells incombination with CIK cells treatment on postoperative renal cancer patients

WU Yu-fei1ZHUANG Zhi-xiang2

(1.Sanxing branch of Zhangjiagang AoYang Hospital，Zhangjiagang 215624, China；2.Dept of Oncology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004，China)

Objective: To study the effect of immune function of tumor antigen-loadedsv(DCs) in combination with cytokine-induced killer(CIK) cells treatment on postoperative renal cancer patients. Methods: Frty-two patients with renal cell carcinoma were chosen after operation(25 males and 17 females, stageⅠ-Ⅲ, median age 57 years (28～73 years) during Mar 2012 to 2014 from The Second Affiliated Hospital of Suzhou University. The function of cell immunity in blood was measured and compared by immunofluorescence at 1 week before and after treatment respectively. The delayed type hypersensitivity (DTH) test was made at 1 week before and after treatment and the rate of DTHwas observed. Results: A week after treatment, the percentages of CD3+, CD4+, CD3+CD56+and the ratio of CD4+/CD8+increased significantly compared to no-treatment (P<0.05),the levels of IL-2, interferon gamma(IFN-γ)increased significantly (P<0.05), Specific DTH reactions to a tumor antigen were obviously enhanced. The positive rate of DTH was 73.80% (31/42), there was no serious adverse reaction. Conclusion: Treatment with tumor cell antigen-loaded cells in combination with CIK cells is safe and effective for postoperative renal cancer patients. The function of cell immunity is enhanced，and the immunological response of the tumor cellsi improved. It can improve the survival benefit of patients'.

renal cell carcinoma; tumor antigen-loaded cells(DCs); cytokine-induced killer(CIK) cells; biological therapy

邬宇飞(1977—),江苏张家港人，主治医师，本科，主要从事恶性肿瘤的免疫治疗工作。

R737.11

A

1004-7115(2016)11-1210-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.11.003

2016-06-12)