基于HPLC的标准加入法同时测定小鼠血清中犬尿氨酸和色氨酸

陈 月 康宏艳 胡 楠 杨 青 郁韵秋△

(1复旦大学药学院药物分析教研室 上海 201203;2复旦大学生命科学学院生物化学与分子生物学系 上海 200438)



基于HPLC的标准加入法同时测定小鼠血清中犬尿氨酸和色氨酸

陈 月1康宏艳1胡 楠2杨 青2郁韵秋1△

(1复旦大学药学院药物分析教研室 上海 201203;2复旦大学生命科学学院生物化学与分子生物学系 上海 200438)

目的 建立一种同时测定小鼠血清中犬尿氨酸和色氨酸浓度的高效液相色谱(HPLC)法,用于评价小鼠给予IDO抑制剂后体内IDO活性。方法 血清用6%高氯酸沉淀蛋白法处理,离心后取上清进样,采用标准加入法定量。选用ThermoHypersil GOLD色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)分离,流动相为乙腈-醋酸钠(15 mmol/L,冰醋酸调pH至 4.0),流速1.1 mL/min,柱温30 ℃,犬尿氨酸和色氨酸的紫外检测波长分别为360 nm和280 nm。结果 犬尿氨酸保留时间为6.10 min,线性范围为0.25～10 μmol/L,检测限为0.09 μmol/L;色氨酸保留时间10.12 min,线性范围为25～1 000 μmol/L,检测限为0.25 μmol/L。精密度、回收率及稳定性等均符合生物样品定量分析方法验证指导原则的要求,并成功应用于62只小鼠血清犬尿氨酸和色氨酸浓度的测定。结论 建立了一种简单、快速、准确的HPLC分析方法,采用标准加入定量方式,可同时测定小鼠血清中犬尿氨酸和色氨酸血药浓度,并成功应用于实际生物样本的测定。

犬尿氨酸; 色氨酸; HPLC; 血清; 标准加入法; 小鼠

色氨酸(tryptophan,Trp)是哺乳类动物合成必需的氨基酸之一,也是构成蛋白质的重要成分,还可以在肝、肾等组织中代谢成为生物活性分子。在哺乳类动物中其主要有两条代谢途径:一是在羟化酶的作用下生成5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),另一条是生成犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)[1]。据估计,在哺乳类动物中经膳食摄入的Trp仅1%左右可被转化成5-HT,剩下99%的Trp经Kyn途径代谢[2],即Trp在色氨酸吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)作用下生成甲酰犬尿氨酸,然后迅速代谢为Kyn[3]。研究表明,Kyn与Trp的比值可以灵敏地监测机体IDO激活状态以及细胞免疫状态,当IDO处于激活状态,即Kyn与Trp的比值变大时,机体往往容易诱发各种疾病,例如病毒感染、自身免疫性疾病和恶性肿瘤等[4]。因此,定量测定机体中Kyn与Trp的含量以及它们的比值具有重要意义,可为相关疾病诊断治疗提供重要依据。

目前,国内外主要采用高效液相色谱(HPLC)法检测Kyn与Trp的含量[5-7],而在同时测定这两种氨基酸时常采用荧光和紫外检测器联用的方式[8],因为Trp含有生色团还有较强的荧光特性,而Kyn只有紫外吸收,因此该方式对仪器设备有一定的要求。也有报道采用高效液相色谱-紫外检测法同时测定Kyn与Trp[9],该报道直接采用水溶液标准曲线的方式定量血清中Kyn与Trp的浓度,即用超纯水配制一系列浓度的Kyn与Trp标准工作液定量,但由于Kyn与Trp均是内源性物质,水溶液基质简单、成分少,而实际测定的生物样品血清基质复杂、成分多,含有大量的血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子等物质,基质的不同会影响和干扰对Kyn与Trp的检测,使其测得的结果产生偏差,所以在对Kyn与Trp定量时,应尽量采用相同或类似的基质。我们采用血清标准加入法进行测定,即先用若干份空白血清分析得到空白血清响应值,然后在空白的血清中分别加入已知不同浓度的Kyn和Trp,以加入后的响应值与空白血清响应值的差值来建立标准曲线,被测物的浓度便可在该标准曲线下计算得到。采用这样的方式对Kyn和Trp进行定量误差更小,也更为科学合理。为此,本文建立了一种简单、快速、准确的HPLC法,可同时测定小鼠血清中Kyn和Trp血药浓度。

材 料 和 方 法

仪器 Hitachi 2130型高效液相色谱仪(包括L-2130四元泵、L-2200自动进样器、L-2455 UV检测器),L-2300色谱柱恒温箱,D-2000 Elite工作站,Direct-Q纯化水系统(美国Millipore公司);TGL-16 g高速台式冰冻离心机(湖南省湘仪集团);VORTEX-5涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造公司);GB204型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);真空泵(美国GAST公司);pH计(上海理达仪器厂)等。

药品和试剂 L-Kyn (美国Sigma公司);L-Trp (美国Sigma公司);乙腈(HPLC级,美国Dikma Technologies公司);醋酸钠,冰醋酸,高氯酸(均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。

试剂及其配制

储备液 精密称取L-Kyn标准品0.002 08 g,用体积百分比为2.5%的高氯酸溶解并于10 mL容量瓶中定容,配成1 mmol/L储备液;精密称取L-Trp标准品0.020 45 g,用体积百分比为2.5%的高氯酸溶解并于5 mL容量瓶中定容,配成20 mmol/L储备液;均于4 ℃条件下储存,临用时稀释至所需浓度。

标准曲线样品 取一定体积的混合空白血清,加入Kyn和Trp储备液适量,涡旋3 min,制得Kyn浓度范围为0.25～10 μmol/L和Trp浓度范围为25～1 000 μmol/L的混合标准曲线样品,空白血清加入同体积的纯水制得。

流动相 精密称取醋酸钠4.922 8 g,用纯水溶解并于100 mL容量瓶中定容,配制成600 mmol/L储备液。待用时,用10 mL量筒量取20 mL,加纯水稀释至800 mL,配制得15 mmol/L溶液,用冰醋酸调节pH 至4.0, 0.45 μm亲水性微孔滤膜过滤制得。

样品的收集及处理

Lewis肺癌荷瘤小鼠模型建立 健康雌性小鼠BALB/c小鼠80只,体质量为(20±1) g,SPF级实验室喂养。用无菌生理盐水将Lewis肺癌细胞制成浓度为1×107/mL的细胞悬液。无菌环境下在小鼠腋下皮下注射0.2 mL上述细胞悬液。

血清样本的收集 小鼠接种后,随机分为8组,每组10只。当肿瘤直径达到5 mm时,首次给药。对照组给予0.2 mL 0.5%CMC(羧甲基纤维素钠),每天一次,灌胃给药。其余7组分别给予相同体积不同种类和剂量的IDO抑制剂,每天一次,灌胃给药,连续给药21天。停药后次日取血,置于干净的促凝管内,采血后650×g离心15 min,分离血清,并于-20 ℃冰箱保存。

血清样品的处理 取100 μL血清样本于1.5 mL离心管中,加入60 μL 6%高氯酸,涡旋1 min,静置5 min,10 000×g离心10 min,取上清进样。

色谱条件 色谱柱:Thermo Hypersil GOLD (250 mm×4.6 mm,5 μm);预柱:Phenomenex C18 (40 mm×3.0 mm,5 μm);流动相:乙腈:醋酸钠(15 mmol/L,冰醋酸调至pH 4.0,体积百分比为8∶92);流速:1.1 mL/min;柱温:30 ℃;进样体积:20 μL;犬尿氨酸紫外检测波长:360 nm;色氨酸紫外检测波长:280 nm。

其中:Au为血清中Kyn的峰面积,As为标准曲线中Kyn总的峰面积,Ab为空白血清Kyn的峰面积,Cs为标准曲线中Kyn的浓度。

Trp采用相同方法进行计算。

结 果

方法学验证

分析方法专属性 在选定的色谱条件下运行Kyn和Trp的混合样品,其中Kyn检测波长为360 nm,Trp检测波长为280 nm,由色谱图(图1～3)可见血清中内源性物质与待测定的物质完全分离,其中Kyn的保留时间为6.10 min,Trp的保留时间为10.12 min,峰形良好,且无其他内源性物质干扰。

标准曲线和线性范围 取EP管(1.5 mL)若干只,各加入混合空白血清90 μL,加入Kyn和Trp对照品溶液10 μL,使血清中Kyn和Trp浓度分别为0.25、0.5、1、2.5、5、10 μmol/L和25、50、100、250、500、1 000 μmol/L,并按上述的血清样本处理方式操作后进行HPLC处理分析。以Kyn和Trp的理论浓度为自变量X,Kyn和Trp的峰面积减空白血清平均值为因变量Y,用最小二乘法作线性回归,得标准曲线方程:Kyn为Y=1 795.1X-17.221 (R2=1),Trp为Y=1 577.4X+8 281.3 (R2=0.999 8)。显示本方法Kyn在0.25～10 μmol/L的浓度,Trp在25～1 000 μmol/L的浓度范围内线性关系良好。

检测限和定量限 按照信噪比3为检测限,信噪比10为定量限。其中Kyn的检测限为0.09 μmol/L,定量限0.25 μmol/L,Trp的检测限为0.25 μmol/L,定量限0.75 μmol/L。

精密度试验 配制高(Kyn 8 μmol/L、Trp 800 μmol/L)、中(Kyn 2.5 μmol/L、Trp 250 μmol/L)、低(Kyn 0.5 μmol/L、Trp 50 μmol/L)和定量下限(Kyn 0.25 μmol/L、Trp25 μmol/L) 4个浓度的标准血样,同样按照上述的血清样本处理方式操作后进行HPLC分析,在同一天内对每一考察浓度平行配制5个样品,进行日内和日间精密度考察,其相对标准偏差(RSD)均小于7%,结果见表1。

表1 Kyn和Trp的精密度

Concentration(μmol/L)Intra-dayInter-dayAssay(μmol/L)RSD(%)Assay(μmol/L)RSD(%)Kyn0.250.251±0.0156.140.239±0.0104.340.50.537±0.0264.770.494±0.0255.162.52.480±0.0893.592.503±0.0240.9887.999±0.0921.157.923±0.1071.34Trp2524.57±0.843.4124.57±0.843.415052.18±1.041.9853.05±1.232.32250255.54±5.272.06259.04±4.961.91800807.23±6.370.79801.77±7.720.96

回收率试验 配制高(Kyn 8 μmol/L、Trp 800 μmol/L)、中(Kyn 2.5 μmol/L、Trp 250 μmol/L)和低(Kyn 0.5 μmol/L、Trp 50 μmol/L)3个浓度的标准血样,同样按照上述的血清样本处理方式操作后进行HPLC分析,在同一天内对每一考察浓度平行配制3个样品,进行回收率试验,Kyn的回收率为95.40%～100.08%,Trp的回收率为99.54%～107.84%(表2)。

表2 Kyn和Trp的回收率

Concentration(μmol/L)Assay(μmol/L)Recovery(%)RSD(%)Kyn0.50.477±0.04695.409.662.52.502±0.078100.083.1487.848±0.17398.102.21Trp5053.92±2.63107.844.88250262.55±4.20105.021.60800796.31±20.1299.542.53

稳定性 分别对样品在4 ℃、25 ℃以及自动进样器条件下进行稳定性考察。具体条件如下:配制高(Kyn 8 μmol/L、Trp 800 μmol/L)和低(Kyn 0.5 μmol/L、Trp 50 μmol/L)两个浓度的样品各3份,分别放置于4 ℃和25 ℃下2 h及4 h、自动进样器条件下4 h及8 h考察其稳定性。测得浓度与标示浓度相比较,偏差均在±10%之内,符合生物样品定量分析方法验证指导原则中稳定性的要求。

方法应用 用该方法同时测定了对照组和7组分别服用不同IDO抑制剂的小鼠血清中Kyn和Trp的浓度及其比值,其中有18例小鼠的血清由于量太少而无法测定,最终共得62例小鼠血清(表3)。t检验证实,只有IDO抑制组1与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05),提示这7组分别服用不同种类和剂量IDO抑制剂的小鼠中,只有第1组IDO抑制剂对于抑制Kyn途径具有明显的抑制作用。

表3 实际生物样品测定结果

讨 论

Kyn和Trp均为内源性物质,对于它们的定量比较困难和复杂,目前国内外也没有明确的关于内源性物质定量的指导性原则。在对小鼠血清Kyn和Trp的测定中,我们考虑到血清中成分多且基质复杂,为了减少基质不同给测定结果带来的偏差,从而提高定量分析的准确性,所以采用了标准加入法对Kyn和Trp进行定量,该方法更为科学合理,并在相关的文献中得到证实[10]。建立标准曲线时,混合空白血清来自于同一批在同样环境下喂养的10只雌性小鼠。

在检测器及波长的选择方面,我们也进行了优化。鉴于Trp有较强的荧光特性,起初我们选择了HPLC-荧光检测法测定Trp,但由于有些实际生物样品中Trp含量较高,测定时会出现超出量程的平头峰而导致无法定量,若通过稀释样品进行分析又会因为Kyn含量较低,测定时低于检测限而导致无法定量,综合考虑2种被测组分的实际浓度后,我们最终选择HPLC-紫外检测法,采用两个不同的波长分别测定Kyn和Trp,该法不需添加其他检测器,更简便易行。

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Simultaneous determination of kynurenine and tryptophan in serum of mice by standard addition method based on HPLC

CHEN Yue1, KANG Hong-yan1, HU Nan2, YANG Qing2, YU Yun-qiu1△

(1DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201203,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Objective A high performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed for the simultaneous determination of kynurenine and tryptophan in the serum of mice,which was used to evaluate IDO activityinvivoin mice treated with IDO inhibitors. Methods Sample was precipitated with 6% perchloric acid to remove protein before centrifugation,then the clear layer was injected.Standard addition method was used for quantitative analysis.Separation was achieved by an Thermo Hypersil GOLD column (250 mm×4.6 mm,5 μm).The mobile phase composed of 15 mmol/L sodium acetate (acetic acid adjust pH to 4.0) and acetonitrile,with a constant flow rate of 1.1 mL/min at 30 ℃.Kynurenineand tryptophan were measured at UV detection wavelength of 360 nm and 280 nm,respectively. Results The retention time of kynurenine was 6.10 min,the linear range was from 0.25 to 10 μmol/L,and the detection limit was 0.09 μmol/L.The retention time of tryptophan was 10.12 min,the linear range was from 25 to 1 000 μmol/L,and the detection limit was 0.25 μmol/L. Precision,accuracy and stability all were accorded with guiding principles for quantitative analysis of biological samples.This method was applied to determinate kynurenine and tryptophan in serum of 62 mice successfully. Conclusions The HPLC method with standard addition quantitative analysis was a simple,rapid and accurate tool for simultaneous determination of kynurenine and tryptophan in serum of mice,which was applied to biological samples successfully.

kynurenine; tryptophan; HPLC; serum; standard addition method; mice

国家自然科学基金(81373396,81573310);高等学校博士学科点专项科研基金(20130071110037)

R917

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.012

2016-05-30;编辑:王蔚)

△Corresponding author E-mail:yqyu@shum.edu.cn

* This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81373396,81573310) and the Research Fund of the Doctoral Program of Higher Education of China (20130071110037).