一种骨髓单个核细胞新型示踪方法——细胞膜染料DiD标记法

王 芬 谢成颖 曲 莹 魏 丹 索元震吴梦瑶 袁 燕 魏勋斌 陈 彤△

(1复旦大学附属华山医院血液科 上海 200040; 2上海交通大学生物医学工程学院Med-X研究院 上海 200030)



一种骨髓单个核细胞新型示踪方法
——细胞膜染料DiD标记法

王 芬1谢成颖2曲 莹1魏 丹2索元震2吴梦瑶1袁 燕1魏勋斌2陈 彤1△

(1复旦大学附属华山医院血液科 上海 200040;2上海交通大学生物医学工程学院Med-X研究院 上海 200030)

目的 检测细胞膜染料DiD对骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BM-MNC)的染色效率和造血功能的影响,并用DiD示踪BM-MNC活体直观观察DiD标记的BM-MNC在小鼠颅骨骨髓内的顺利归巢。 方法 体外流式细胞术分析方法和激光共聚焦扫描显微镜成像方法检测BM-MNC的DiD染色效率;CCK-8细胞活性-增殖实验和造血集落形成实验,检测DiD染料对BM-MNC的造血功能的影响;单/双光子共聚焦显微镜下活体直观观察DiD标记的BM-MNC在小鼠颅骨骨髓内的归巢。结果 BM-MNC的DiD染色效率高达90%以上,且DiD对BM-MNC的细胞活性-增殖和造血能力均无明显的毒性影响(P>0.05);单/双光子共聚焦显微镜下,在活体小鼠颅骨骨髓内可直观观察到DiD标记的BM-MNC的顺利归巢。结论 细胞膜染料DiD对BM-MNC的染色效率高、均一,无明显细胞毒性,荧光不易被淬灭,且受机体自身组织的背景干扰少,用于活体示踪时DiD标记的BM-MNC可顺利归巢到骨髓。

细胞膜染料; 骨髓单个核细胞; 造血干细胞移植

骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell ,BM-MNC)作为造血干细胞(hematopoietic stem cell ,HSC)的主要来源之一,具有多种临床治疗潜能,且短时间易获取、不需要体外培养,目前已成功应用于临床上的造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation ,HSCT)[1-4]。BM-MNC的活体示踪研究,对临床调控HSCT后的HSC归巢及拓宽骨髓HSC在其他再生治疗领域的应用具有重要意义。 在以往的BM-MNC示踪研究中[5-8],BM-MNC的示踪方法主要有放射性核素标记探针如111Indium和technetium-99 (99Tc)、报告基因标记如PAI-1、细胞膜染料标记如CFSE和PKH等。然而,这些体内示踪方法都存在一定的缺点和局限性。放射性核素的半衰期短,不宜用于长时间观察,且具有细胞毒性[9];报告基因标记需要长期稳定转染[10]。目前所用到的CFSE和PKH所发出的荧光波段和机体组织的自身荧光波段有所重叠(均在510 nm左右),使得移植细胞的荧光易受自身荧光的背景干扰[11]。

DiD为一种新型的亲脂性细胞膜染料(属于一个亲脂性示踪染料家族,该家族还包括 DiO,DiI,DiR 等),其化学名称为1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚菁,分子式为C61H99ClN2O4,相对分子质量为959.91,基本无细胞毒性,可用来染细胞膜和其他脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度迅速增强,染料迅速均匀分布在整个细胞膜上。该族染料均有着很高的淬灭常数和激发态寿命,高荧光强度至少维持在30天,甚至长达2年以上[12-13]。DiD可被He-Ne 激光器发出的633 nm 波长激发光激发,发射光峰值在 665 nm,与机体组织自发荧光谱窗基本不重叠。DiD的染色效率高、均一,不易猝灭,无明显细胞毒性,且受自身荧光背景干扰小。目前DiD已成功应用于多种细胞的体内示踪研究,如Treg细胞、间充质干细胞、肿瘤细胞、造血干祖细胞等[12,14-16]。

本研究目的在于检测细胞膜染料DiD对BM-MNC的染色效率和造血功能的影响,并用DiD示踪BM-MNC,活体直观观察DiD标记的BM-MNC在小鼠颅骨骨髓内的顺利归巢。

材 料 和 方 法

实验动物 本实验所使用的8～10周龄 BALB/c雄性 SPF级小鼠,体质量为 (23±2) g,由上海市斯莱克实验动物有限公司提供,饲养于复旦大学药学院张江动物房 SPF 级环境。

主要试剂和仪器 细胞膜染料DiD(货号 D307;规格25 mg;品牌Invitrogen Molecular Probes);小鼠骨髓单个核细胞分离液(货号TBD2013LM;规格2×100 mL/kit;品牌天津灏洋TBD);红细胞裂解液(货号9-140331-4;规格500 mL;品牌GENMED);类胎牛血清FBS(货号SV30184.02;规格500 mL;品牌HyClone);小鼠集落形成试剂盒MethoCultTMGFM 3434(货号EXP.MM/YYYY;规格100 mL;品牌Stem Cell);CCK8(货号CK04;规格500孔;品牌DOJINDO)。体外流式细胞仪(型号FACSAriaTMIII;品牌BD);激光共聚焦显微镜(型号LEICA TCS SP5;品牌LEICA);双光子共聚焦显微镜(型号A1RMP;品牌尼康)。

实验方法

密度梯度离心法提取BM-MNC 8～12周龄 BALB/c 雄性SPF级小鼠过量麻醉处死,置于75%酒精中浸泡5 min后,无菌条件下剥离股骨和胫骨,用F 液冲洗出全部骨髓液,200目筛网过滤后,500×g,离心20 min,弃上清。沉淀重复用F液洗涤1次后用全血及组织稀释液悬起(细胞浓度为2×108～1×109/mL)。将悬液小心叠加在C 液液面上(重悬骨髓液与C液比例为1∶1),400×g,离心20 min,最小加速度。然后收集第二层乳白色细胞,将其放入含4～5 mL细胞洗涤液的离心管中,充分混匀后,500×g,离心20 min。离心后的沉淀经PBS反复洗涤2 次即为所需的BM-MNC。

DiD标记BM-MNC 将BM-MNC重悬于PBS内[细胞浓度约在(2～3)×106/mL]。避光环境中,向每mL细胞悬液中加入 5 μL 浓度为1 mmol/L的DiD 储存子液,轻轻吹打,使染料和细胞悬液充分混匀,置于 37 ℃电热恒温水浴箱内摇晃染色 40 min。加入PBS冲洗悬液,400×g,离心5 min,弃上清,沉淀再经PBS反复洗涤2次即为DiD标记的BM-MNC。

DiD对BM-MNC造血功能的毒性检测 主要采用骨髓单个核细胞的CCK-8细胞活性-增殖实验和造血集落形成实验,来检测DiD染料对BM-MNC造血功能的毒性影响。

CCK-8细胞活性-增殖实验 DiD标记的BM-MNC和未标记的BM-MNC分别作为实验组和阴性对照组,两组均用10% FBS/IMDM重悬至1×106/mL细胞浓度,分别接种在同一96孔板上,每组接种3孔,每孔接种100 μL细胞悬液,并以100 μL无细胞的10% FBS/IMDM作为空白对照。接种后,将96孔板置于37 ℃培养箱内培养2 h,待细胞状态稳定后,向每组每孔内加入CCK-8试剂10 μL,混匀后再置于上述培养箱内继续培养。24 h后拿出孔板,置于酶联免疫检测仪中,于450 nm波长处测定孔板上各孔的光吸收值。

造血集落形成实验 DiD标记的BM-MNC和未标记的BM-MNC分别作为实验组和阴性对照组,两组均用10% FBS/IMDM重悬至2.5×105/mL细胞浓度,然后与集落形成培养基充分混匀,分别接种在中培养皿内,每组接种3皿,每皿接种300 μL,密度为2.5×105/mL细胞。接种后,将培养皿静置于4 ℃冰箱中5 min,排除液体内的气泡,再将培养皿转移到37 ℃培养箱,12天后计算两组的各种集落及总集落的形成情况。重复3次试验后,统计结果。小鼠BM-MNC培养后形成的造血集落主要有3种:BFU-E(爆式红系集落形成单位)、CFU-GM(粒单核系集落形成单位)、CFU-GEMM(粒单核系-巨核细胞-红系集落形成单位)。本实验计数各种集落的标准为:BFU-E约在孵育后10～14天计数,其特点是集落边缘杂细胞少,形态不规则,集落呈红色或者黑褐色,里面由多个独立的、不规则的小集落组成;CFU-GM约在孵育后10～14天计数,其特点是边缘细胞多,呈辐射状,细胞集落总形态呈圆形或者椭圆形,非常规则,集落可呈灰色或者深灰色(高密度),其中CFU-G细胞偏小、发亮、更规则,CFU-M细胞偏大、呈灰色团;CFU-GEMM约在孵育后10～14天计数,其特点是细胞集落多于500个细胞,在CFU-GM的基础上,可发现不规则的红系E分布在CFU-GEMM集落的周围。

活体观察DiD标记的BM-MNC在颅骨骨髓内的归巢 移植后24 h ,深度麻醉小鼠,尾静脉注射100 μL 浓度为10 mg/mL的 FITC-Dextran来标记颅骨骨髓内的血管。对颅骨骨髓观察区进行备皮,头皮纵行切口,去除覆盖在骨质表面的骨膜,暴露颅骨,并滴少量无菌PBS于骨表面(以防骨表面水分蒸发变干而降低成像效果)。将小鼠放在单/双光子共聚焦显微镜下观察,主要观察中央静脉和冠状静脉交叉形成的十字形血管周边的颅骨骨髓区。扫描结束后,对小鼠伤口进行消毒、缝合处理,随后将小鼠单独放在一个饲养笼子里面,待其苏醒。整个实验过程注意维持小鼠体温的稳定。

统计方法 采用Stata 10.0软件进行统计分析。若总体分布服从正态分布且方差齐性,则行单因素方差分析(One way ANOVA)和t检验;若总体分布不服从正态分布或方差不齐,则行秩和检验(包括Kruskal-Wallis H)。α=0.05为检验水平,P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

BM-MNC的DiD染色效率 本实验主要采用体外流式细胞术分析方法和激光共聚焦扫描显微镜成像方法检测 BM-MNC的DiD染色效率。图 1和图2分别为体外流式细胞术分析图和激光共聚焦扫描显微镜成像图。这两种方法的结果均显示,BM-MNC的DiD染色效率可达90%上,可满足体内示踪移植细胞的实验要求[11]。

DiD对BM-MNC造血功能的毒性检测 本实验主要采用BM-MNC的CCK-8细胞活性-增殖实验和造血集落形成实验,来检测DiD染料对BM-MNC造血功能的毒性影响,实验结果采用t检验进行统计分析。图3为DiD染料对BM-MNC活性-增殖能力的影响图,结果显示,DiD+标记组(DiD+组)的BM-MNC的平均活性-增殖能力虽略低于未标记组(对照组),但差异无统计学意义(P=0.107 4)。图4为DiD染料对BM-MNC造血集落形成能力的影响图,结果显示,DiD+标记组(DiD+组)和未标记组(对照组)的BM-MNC在红系BFU-E (P=0.814 5)、粒单核系CFU-GM (P=0.398 2)、粒-单核-巨核-红系集落CFU-GEMM (P=0.854 2),以及总集落形成 (P=0.449 5)方面,均无明显差别。

活体观察DiD标记的BM-MNC在颅骨骨髓内的归巢 为了进一步观察DiD标记的BM-MNC在生物体内是否顺利归巢到骨髓,我们采用了单/双光子共聚焦显微镜,活体直观观察DiD标记的BM-MNC在小鼠颅骨骨髓内的归巢。小鼠颅骨骨髓主近[19](图5)。观察6～10只小鼠后,结果显示,每只小鼠颅骨骨髓区内均有BM-MNC的分布(图6)。

讨 论

BM-MNC来源于骨髓,主要由造血干细胞和间充质干细胞组成,负责造血及协助造血;骨髓也是BM-MNC移植后的主要归巢部位,BM-MNC归巢到骨髓后的主要功能即重建造血[17-18]。

BM-MNC作为HSC的主要来源之一,目前已成功应用于临床上的造血干细胞移植,BM-MNC的活体示踪研究,对临床调控HSCT后的HSC归巢及拓宽骨髓HSC在其他再生治疗领域的应用具有重要意义。与传统的示踪BM-MNC的方法相比,DiD作为一种新型的亲脂性细胞膜染料,染色效率高、均一,有着很高的淬灭常数和激发寿命,其光谱窗与机体组织自身荧光谱窗基本不重叠,移植细胞的荧光受机体自身组织的背景干扰少,且无明显细胞毒性,目前已用于多种细胞的体内示踪研究[12,14-16]。

本研究目的主要在于检测细胞膜染料DiD对BM-MNC的染色效率和造血功能的影响,并用DiD示踪BM-MNC,活体直观观察DiD标记的BM-MNC在小鼠颅骨骨髓内的顺利归巢。结果显示,BM-MNC的DiD染色效率高达90%以上;且DiD对BM-MNC的细胞增殖能力和造血能力均无明显的毒性影响;单/双光子共聚焦显微镜下,在活体小然而近来有文献报道,细胞膜染料可能存在染料转移的现象——即移植后的细胞膜染料标记细胞在机体内死亡后可被机体内的单核巨噬细胞吞噬,继而膜染料会整合到这些免疫细胞上,导致这些免疫细胞也会显示荧光[20]。这意味着DiD示踪BM-MNC的作用还有待进一步验证和研究。而以往所有示踪BM-MNC的方法也都存在一定的局限性,如不宜长时间观察、具有细胞毒性[9],需要长期稳定转染报道基因[10],容易受自身组织的背景干扰[11]等。DiD作为一种新型的亲脂性细胞膜染料,克服了以往方法的诸多缺点和局限性,基本无细胞毒性;其具有很高的淬灭常数和激发态寿命,高荧光强度至少维持在30天,甚至长达2年以上[12-13];发射光峰值在 665 nm,与机体组织自发荧光谱窗基本不重叠,受自身荧光背景干扰少。DiD标记的BM-MNC染色效率高且均一、无明显细胞毒性、染料不易淬灭观察时间较长,且自身荧光背景干扰少,可成功归巢到活体小鼠骨髓,DiD标记的BM-MNC未来有望应用于骨髓单个核细胞与造血干细胞的长时间体内示踪研究。

A:The comparison of capacity to form BFU-E between control and DiD+group; B:The comparison of capacity to form CFU-GM between control and DiD+group; C:The comparison of capacity to form CFU-GEMM between control and DiD+group; D:The comparison of total colony number between control and DiD+group and the typical picture of two groups taken under the light microscope (4×).

图 4 DiD对BM-MNC造血集落形成能力的影响图

Fig 4 The effects of capacity of hematopoietic colony forming on BM-MNC by DiD

鼠颅骨骨髓内可直观观察到DiD标记的BM-MNC的顺利归巢。以上结果均表明,DiD标记的BM-MNC可用于活体示踪研究。

[1] CUENDE N,RICO L,HERRERA C.Concise review:bone marrow mononuclear cells for the treatment of ischemic syndromes:medicinal product or cell transplantation?[J].StemCellsTranslMed,2012,1(5):403-408.

[2] AGHAYAN HR,ARJMAND B,YAGHOUBI M,etal.Clinical outcome of autologous mononuclear cells transplantation for spinal cord injury:a systematic review and meta-analysis[J].MedJIslamRepubIran,2014,28:112.

[3] AFZAL MR,SAMANTA A,SHAH ZI,etal. Adult bone marrow cell therapy for ischemic heart disease:evidence and insights from randomized controlled trials[J].CircRes,2015,117(6):558-575.

[4] MESENTIER-LOURO LA,ZAVERUCHA-DO-VALLE C,ROSADO-DE-CASTRO PH,etal.Bone marrow-derived cells as a therapeutic approach to optic nerve diseases[J].StemCellsInt,2016,2016:5078619.

[5] CUI J,WAHL RL,SHEN T,etal.Bone marrow cell trafficking following intravenous administration[J].BrJHaematol,1999,107(4):895-902.

[6] WISENBERG G,LEKX K,ZABEL P,etal. Cell tracking and therapy evaluation of bone marrow monocytes and stromal cells using SPECT and CMR in a canine model of myocardial infarction[J].JCardiovascMagnReson,2009,11:11.

[7] BARBOSA DA FONSECA LM,XAVIER SS,ROSADO DE CASTRO PH,etal.Biodistribution of bone marrow mononuclear cells in chronic chagasic cardiomyopathy after intracoronary injection[J].IntJCardiol,2011,149(3):310-314.

[8] VASCONCELOS-DOS-SANTOS A,ROSADO-DE-CASTRO PH,LOPES DE SOUZA SAetal.Intravenous and intra-arterial administration of bone marrow mononuclear cells after focal cerebral ischemia:Is there a difference in biodistribution and efficacy?[J].StemCellRes,2012,9(1):1-8.

[9] KOJIMA H.Development of near-infrared fluorescent probes forin-vivoimaging[J].YakugakuZasshi,2008,128(11):1653-1663.

[10] WANG H,CAO F,De A,etal. Trafficking mesenchymal stem cell engraftment and differentiation in tumor-bearing mice by bioluminescence imaging[J].StemCells,2009,27(7):1548-1558.

[11] PARISH CR.Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies[J].ImmunolCellBiol,1999,77(6):499-508.

[12] FUJISAKI J,WU J,CARLSON AL,etal.Invivoimaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche[J].Nature,2011,474(7350):216-219.

[13] VON BARTHELD CS,CUNNINGHAM DE,RUBEL EW.Neuronal tracing with DiI:decalcification,cryosectioning,and photoconversion for light and electron microscopic analysis[J].JHistochemCytochem,1990,38(5):725-733.

[14] TEO GS,YANG Z,CARMAN CV,etal.Intravital imaging of mesenchymal stem cell trafficking and association with platelets and neutrophils[J].StemCells,2015,33(1):265-277.

[15] SIPKINS DA,WEI X,WU JW,etal.Invivoimaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment[J].Nature,2005,435(7044):969-973.

[16] LO CC,FLEMING HE,WU JW,etal. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche[J].Nature,2009,457(7225):92-96.

[17] VAIDYAA,KALE V.Hematopoietic stem cells,their niche,and the concept of co-culture systems:A critical review[J].JStemCells,2015,10(1):13-31.

[18] FAJARDO-ORDUNA GR,MAYANI H,MONTESINOS JJ.Hematopoietic support capacity of mesenchymal stem cells:biology and clinical potential[J].ArchMedRes,2015,46(8):589-596.

[19] LO CC,LIN CP,SCADDEN DT.Invivoimaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow[J].NatProtoc,2011,6(1):1-14.

[20] LASSAILLY F,GRIESSINGER E,BONNET D.“Microen-vironmental contaminations” induced by fluorescent lipophilic dyes used for noninvasiveinvitroandinvivocell tracking[J].Blood,2010,115(26):5347-5354.

A new tracing method of bone marrow mononuclear cells by cell membrane dye Di

DWANG Fen1, XIE Cheng-ying2, QU Ying1, WEI Dan2, SUO Yuan-zhen2,WU Meng-yao1, YUAN Yan1, WEI Xun-bing2, CHEN Tong1△

(1DepartmentofHematology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;2Med-XResearchInstitute,SchoolofBiomedicalEngineering,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200030,China)

Objective To detect the labeling efficiency of DiD on bone marrow mononuclear cells (BM-MNC) and the effects of hematopoiesis on BM-MNC imposed by DiD,and then directly observe the successful homing of transplanted BM-MNC labeled by DiD in a live mouse skull marrow.Methods We detected the labeling efficiency of DiD on BM-MNC byinvitroflow cytometry and confocal laser scanning microscopy.We also detected the effects of DiD hematopoiesis on BM-MNC by CCK8 test and colony forming assay,and directly observed the homing of transplanted BM-MNC labeled by DiD in a live mouse skull marrow under the single/two-photon confocal laser scanning microscope. Results The labeling efficiency of DiD on BM-MNC was up to 90%,and the cell vitality-proliferation and capacity to produce blood cells of BM-MNC were changed very little after being labeled by DiD (P>0.05).The transplanted BM-MNC labeled by DiD could be seen successfully homing to skull marrow in a live mouse under the single/two-photon confocal laser scanning microscope. Conclusions DiD has high and uniform labeling efficiency,non-toxic to cell functions,low rate of fluorescence quenching,low interference from autofluorescence of tissue,and the BM-MNC labeled by DiD could home to bone marrow successfully in a live mouse.

cell membrane dye; bone marrow mononuclear cells; hemapoietic stem cell transplantation

国家自然科学基金(81561138002,91542109);上海市基础研究重点项目(13JC1406404);上海市优秀学术带头人计划(16XD1400600)

R457.7

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.010

2016-05-06;编辑:张秀峰)

△Corresponding author E-mail:chentong@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81561138002,91542109),the Key Program of Basic Research of Shanghai (13JC1406404) ,and the Excellent Leading Scholar Program of Shanghai (16XD1400600).