胰腺癌细胞中TGF-β1对Foxp3表达的影响

曹亚峰，衣 昕

(1.同济大学附属杨浦区中心医院血液科，上海 200090；2.南通大学医学院人体解剖学系，江苏南通 226001)



·经验交流·

胰腺癌细胞中TGF-β1对Foxp3表达的影响

曹亚峰1，衣 昕2△

(1.同济大学附属杨浦区中心医院血液科，上海 200090；2.南通大学医学院人体解剖学系，江苏南通 226001)

目的 探讨胰腺癌细胞分泌的转化生长因子β1(TGF-β1)对正常人外周血单个核细胞(PBMC)转录因子Foxp3表达的影响。方法 利用Transwell小室建立胰腺癌细胞CF-PAC1与PBMC的共培养体系，分为A组(PBMC)，B组(PBMC-CF-PAC1)，C组[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗体(1 μL)]，D组[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗体(2 μL)]，E组[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗体(4 μL)]，F组[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗体(8 μL)]，G组[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗体(16 μL)]。采用酶联免疫吸附法检测共培养体系中加入TGF-β1抗体前、后细胞培养液中TGF-β1的水平。采用Western blot法、免疫荧光方法检测共培养体系中加入TGF-β1抗体前、后PBMC中Foxp3的表达量。结果 A组TGF-β1平均浓度为(12.44±2.08)ng/mL，B组TGF-β1平均浓度为(14.12±1.25)ng/mL，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着加入TGF-β1抗体浓度的增加，各组TGF-β1水平呈递减趋势(P<0.05)。B组PBMC中Foxp3蛋白相对表达量明显高于A组(P<0.05)，其余6组PBMC细胞中Foxp3蛋白的表达量随着加入TGF-β1抗体浓度的增加，呈递减趋势(P<0.05)。结论 胰腺癌细胞可通过调整肿瘤微环境中TGF-β1影响PBMC细胞中Foxp3蛋白的表达。

胰腺肿瘤；受体，转化生长因子β；外周血单个核细胞；转化生长因子β1；Foxp3

Sakaguchi等[1]学者研究证实天然CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)具有免疫抑制作用，此类细胞以“主动”的方式调控机体免疫应答及免疫耐受，在移植免疫、肿瘤免疫中发挥着重要的作用。当机体逐渐形成恶性肿瘤时，Treg细胞会产生大量包括转化生长因子-β1(TGF-β1)在内的免疫抑制因子，显著抑制抗肿瘤免疫。Foxp3在构建Treg体系中起主导作用，对Treg的形成和功能发挥具有重要的作用，是叉头样转录因子家族中的一员，被认为是Treg细胞标志性分子[2-3]。本研究采用正常人外周血中分离出正常人外周血中单个核细胞(PBMC)，体外培养胰腺癌细胞CF-PAC1、利用Transwell小室建立胰腺癌细胞CF-PAC1与PBMC的共培养体系，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测共培养体系中加入TGF-β1抗体前、后细胞培养液中TGF-β1水平。采用Western blot法、免疫荧光方法检测共培养体系中加入TGF-β1抗体前、后PBMC细胞中Foxp3的表达量。本研究欲了解TGF-β1与Foxp3之间的关系，以期通过调控TGF-β1来影响Treg功能和数量以便进一步发挥机体的免疫调节作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年9月1日至2013年5月31日期间体检无特殊的健康人外周血，提取PBMC。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的提取 提取健康人PBMC。适量淋巴细胞分离液加入离心管中，肝素抗凝静脉血与等量磷酸盐缓冲液(PBS)充分混匀，用滴管沿管壁缓慢滴混匀液于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2 000 r/min 20 min后，管内可见3层，PBMC为主的白色云雾层狭窄带位于上、中层界面处，用毛细吸管插到云雾层吸取PBMC，置入另一短中管中，加入5倍体积的PBS液，水平离心1 500 r/min 10 min，洗涤细胞2次。末次离心后，弃上清液，加入含有10%小牛血清的DMEM，调整PBMC浓度为2×105/mL。

1.2.2 Transwell小室建立共培养体系 将胰腺癌细胞CF-PAC1(上海中科院细胞库购买)调整细胞数约为2×106/孔，加入2.6 mL DMEM培养液于6孔板中培养，调整细胞状态；将0.4 μm Transwell小室放入6孔板中，小室内置入1.5 mL提取得到的PBMC细胞悬液。试验分组如下。(1)A组：即PBMC组，共培养下层6孔板中，加入调整PBMC细胞数为2×106的DMEM培养液2.6 mL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室内加入PBMC细胞数为2×105的DMEM培养液1.5 mL；(2)B组：即PBMC-CF-PAC1组。共培养下层6孔板中，加入胰腺癌细胞CF-PAC1，调整细胞数为2×106，DMEM培养液2.6 mL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室内加入PBMC细胞数为2×105的DMEM培养液1.5 mL；(3)C组：即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗体(1 μL)组，共培养下层6孔板中，加入胰腺癌细胞CF-PAC1，调整细胞数为2×106，DMEM培养液2.6 mL，同时加入抗TGF-β1抗体1 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室内加入PBMC细胞数为2×105的DMEM培养液1.5 mL；(4)D组：即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗体(2 μL)组。共培养下层6孔板中，加入胰腺癌细胞CF-PAC1，调整细胞数为2×106，DMEM培养液2.6 mL，同时加入抗TGF-β1抗体2 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室内加入PBMC细胞数为2×105的DMEM培养液1.5 mL；(5)E组：即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗体(4 μL)组。共培养下层6孔板中，加入胰腺癌细胞CF-PAC1，调整细胞数为2×106，DMEM培养液2.6 mL，同时加入抗TGF-β1抗体4 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室内加入PBMC细胞数为2×105的DMEM培养液1.5 mL；(6)F组：即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗体(8 μL)组，共培养下层6孔板中，加入胰腺癌细胞CF-PAC1，调整细胞数为2×106，DMEM培养液2.6 mL，同时加入抗TGF-β1抗体8 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室内加入PBMC细胞数为2×105的DMEM培养液1.5 mL。(7)G组，即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗体(16 μL)组，共培养下层6孔板中，加入胰腺癌细胞CF-PAC1，调整细胞数为2×106，DMEM培养液2.6 mL，同时加入抗TGF-β1抗体16 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室内加入PBMC细胞数为2×105的DMEM培养液1.5 mL。

1.2.3 利用ELISA法检测TGF-β1水平 按照TGF-β1 ELISA试剂盒(BD公司)说明书步骤，检测培养液中TGF-β1的水平。

1.2.4 Western blot法检测PBMC中Foxp3的蛋白水平 提取Transwell小室中PBMC细胞总蛋白，按Bradford法进行蛋白总量测定，冻存于-70 ℃冰箱待用。蛋白样品与6×上样缓冲液混合，100 ℃水浴5 min，置冰上冷却，采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳垂直电泳进行分离，每组上样量45 μg，电压120 V，溴酚蓝到底后停止。Bio-Rad半干转印系统转膜15 V，1 h用TBST缓冲液洗膜3次，并用5%脱脂奶粉封闭1.5 h，再用兔抗Foxp3(1∶1 000，proteintech公司)，鼠抗β-actin(1∶1 500，Sigma公司)孵育，4 ℃过夜，TBST缓冲液洗涤3次后分别加入辣根过氧化物酶结合的抗兔免疫球蛋白G(IgG，北京中山金桥公司)和抗鼠IgG(北京中山金桥公司)室温孵育4 h。 TBST缓冲液洗涤3次后加入电化学发光(ECL)发光液(Pierce公司)，胶片曝光l min后显影、定影、晾干。

1.2.5 Foxp3免疫荧光方法检测 在EP管中加入适量0.01 mol/L PBS洗涤收集的细胞3次，0.2% Triton X-100破膜15 min，0.01 mol/L PBS洗涤10 min×3次，5%牛血清清蛋白(BSA)封闭1 h。加入鼠抗Foxp3单克隆抗体(北京中山金桥公司)4 ℃孵育过夜，0.01 mol/L PBS洗涤10 min×3次，FITC标记的山羊抗小鼠IgG室温避光孵育2 h，0.01 mol/L PBS洗涤10 min×3次，Hoechst室温避光孵育5 min，染细胞核，双蒸水(ddH2O)洗涤10 min×3次，甘油-Tris封片，激光共聚焦显微镜下观察结果，激发波长为488 nm和380 nm。

2 结 果

2.1ELISA法检测细胞培养液中TGF-β1水平。

2.1.1A、B组细胞培养液中TGF-β1水平的比较A组TGF-β1平均浓度为(12.44±2.08)ng/mL，B组TGF-β1平均浓度为(14.12±1.25)ng/mL，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.1.2B、C、D、E、F和G组细胞培养液中TGF-β1水平的比较 随着加入TGF-β1抗体浓度的增加，各组TGF-β1水平呈递减趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2Westernblot法检测各组PBMC中Foxp3蛋白表达量

2.2.1A、B组PBMC中Foxp3蛋白表达量比较Westernblot法检测结果显示B组PBMC中Foxp3蛋白相对表达量明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2.2B、C、D、E、F和G组PBMC中Foxp3蛋白表达量比较Westernblot法检测结果显示，6组PBMC细胞中Foxp3蛋白的表达量随着加入TGF-β1抗体浓度的增加，呈递减趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

表1 6组细胞培养液中TGF-β1水平比较

图1 Western blot检测A、B组PBMC中Foxp3蛋白表达量

图2 Western blot检测6组PBMC中Foxp3蛋白表达量

2.3Foxp3免疫荧光方法检测

2.3.1A、B组Foxp3荧光检测结果B组Foxp3阳性细胞数量明显多于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 A、B组Foxp3免疫荧光方法检测结果

2.3.2B、C、D、E、F和G组Foxp3荧光检测结果 6组Foxp3阳性细胞数量随着加入TGF-β1抗体浓度的增加，呈递减趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 6组Foxp3免疫荧光检测结果

3 讨 论

有研究表明，Treg细胞在肿瘤微环境中升高,Treg细胞能够抑制恶性肿瘤组织中CD8+T、CD4+T淋巴细胞及自然杀伤细胞(naturekillercells,NK)等表达，并且抑制其迁移到肿瘤局部，发挥抑制抗肿瘤免疫效应的作用[1]，但是Treg细胞在肿瘤微环境中升高的机制尚不明确。

Valzasina等[4]学者在研究肿瘤负荷小鼠时观察到，小鼠体内CD4+CD25+T细胞向Treg细胞转化是Treg增殖的主要来源之一。有研究观察到，TGF-β1可以促进CD4+CD25+T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg转化，参与了体内Treg细胞增殖过程，进一步促进免疫负调节效应[5]。CD4+CD25+Treg细胞特异标志性分子Foxp3蛋白是其生长、分化和功能发挥的关键基因。有关试验动物研究发现，Foxp3mRNA的表达量对外周血Treg细胞数量及功能的影响有着至关重要的意义。scurfy小鼠Foxp3基因缺失，表现出的是CD4+CD25+Treg细胞的缺失，这表明Foxp3基因是CD4+CD25+Treg细胞生长和分化过程中不可缺失的促进因子[6-7]。由此推测，上调Foxp3基因的表达可能会促进肿瘤组织中CD4+T细胞向Treg细胞转变，促进Treg细胞增殖使得肿瘤组织产生抑制免疫效应。

本研究用Transwell培养体系模拟肿瘤微环境，肿瘤细胞与淋巴细胞互相作用，试验结果显示，胰腺癌细胞CF-PAC1可分泌一定浓度的TGF-β1。有关文献报道，5 000pg/mL的TGF-β1可将活化的CD4+T细胞诱导转化为Treg细胞[8]。本试验还观察胰腺癌细胞CF-PAC1分泌的TGF-β1的水平与Foxp3的表达存在关系，胰腺癌细胞CF-PAC1能够显著上调正常人PBMC中Foxp3蛋白的表达，而且该作用能被TGF-β1抗体所拮抗。本研究结果表明，胰腺癌细胞可分泌产生TGF-β1，从而促进了PBMC中Foxp3蛋白的表达，进一步推断胰腺癌细胞分泌的TGF-β1可促进Treg细胞的分化和自身增殖，可对机体的免疫功能起进一步的抑制作用。

Moo-Young等[8]也发现，高表达TGF-β1的胰腺癌细胞pan02可诱导小鼠大量CD4+T细胞转化为CD4+FOXP3+Treg细胞，而低表达TGF-β的胰腺癌细胞未观察到此现象。本研究结果也发现类似的现象。这些证据表明肿瘤来源的TGF-β1可促进CD4+Foxp3+Treg细胞的增殖，这也是肿瘤免疫抑制的重要机制之一。

综上所述，可以通过TGF-β1对Foxp3的表达量进行调控，且进一步调控Treg细胞的数目及功能活性，从而影响肿瘤免疫抑制功能的发挥。

[1]SakaguchiS,MiyaraM,CostantinoCM,etal.Foxp3+regulatoryTcellsinthehumanimmunesystem[J].NatRevImmunol,2010,10(7):490-500.

[2]SakaguchiS.NaturallyarisingFoxp3-expressingCD25+CD4+regulatoryTcellsinimmunologicaltolerancetoselfandnon-self[J].NatureImmunol,2005,6(4)：345-352.

[3]ZhouX,Bailey-BucktroutS,JekerLT,etal.PlasticityofCD4+Foxp3+Tcells[J].CurOpinImmunol,2009,21(3):281.

[4]ValzasinaB,PiconeseS,GuiducciC,etal.Tumor-inducedexpansionofregulatoryTcellsbyconversionofCD4+CD25lymphocytesisthymusandproliferationindependent[J].CancerRes,2006,66(8):4488-4495.

[5]AttisanoL,WranaJL.SignaltransductionbytheTGF-βsuperfamily[J].Science,2002,296(5573):1646-1647.

[6]PetersenRP,CampaMJ,SperlazzaJ,etal.TumorinfiltratingFoxp3+regulatoryT-cellsareassociatedwithrecurrenceinpathologicstageⅠNSCLCpatients[J].Cancer,2006,107(12):2866-2872.

[7]PerroneG,RuffiniPA,CatalanoV,etal.IntratumouralFoxp3-positiveregulatoryTcellsareassociatedwithadverseprognosisinradicallyresectedgastriccancer[J].EurJCancer,2008,44(13):1875-1882.

[8]Moo-YoungTA,LarsonJW,BeltBA,etal.TumorderivedTGF-ΒmediatesconversionofCD4+Foxp3+regulatoryTcellsinamurinemodelofpancreascancer[J].JImmunoth,2009,32(1):12-21.

曹亚峰(1990-)，住院医师，硕士，主要从事消化内科研究。△

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.045

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1671-8348(2016)23-3290-03

2016-01-17

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