维吾尔族宫颈病变中VEGF-C与HPV相关性研究*

王新玲，李昭昭，古扎丽努尔·阿不力孜，夏 鸣

(1.新疆医科大学附属肿瘤医院妇外四科，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学附属肿瘤医院妇外五科，乌鲁木齐 830011;3.重庆医科大学第一临床学院，重庆400046)



·论 著·

维吾尔族宫颈病变中VEGF-C与HPV相关性研究*

王新玲1，李昭昭1，古扎丽努尔·阿不力孜2△，夏 鸣3

(1.新疆医科大学附属肿瘤医院妇外四科，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学附属肿瘤医院妇外五科，乌鲁木齐 830011;3.重庆医科大学第一临床学院，重庆400046)

目的 探讨血管内皮生长因子C(VEGF-C)在维吾尔族宫颈病变[宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ～Ⅲ及早期宫颈癌]组织中的表达及其与人乳头瘤病毒(HPV)载量相关性。方法 采用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)法测定140例维吾尔族妇女(慢性宫颈炎30例，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各20例,早期宫颈癌50例)宫颈石蜡切片组织中VEGF-C的水平；术前用第2代杂交捕获(HC-Ⅱ)方法测定同一患者术前宫颈HPV载量；比较2个指标同宫颈病变的关联。结果CINⅡ、CINⅢ及早期宫颈癌组织VEGF-C水平、宫颈病变程度及HPV载量均高于慢性宫颈炎组织(P<0.05)；组织中VEGF-C水平与HPV载量呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 新疆维吾尔族妇女宫颈组织中VEGF-C水平、HPV载量均与宫颈病变严重程度相关，且二者存在协同作用。

宫颈肿瘤；宫颈疾病；血管内皮生长因子；人乳头瘤病毒

宫颈癌在女性恶性肿瘤中发病率排第4位[1]，是维吾尔族妇女高发的恶性肿瘤，总生存率排第7位[2-3]。据报道，宫颈癌发病人数约有50万/年，死亡人数将近3万/年。在中国，新疆是宫颈癌高发的地区。目前已经确定人乳头瘤病毒 (human pappilomavirus,HPV)的持续感染是宫颈癌前病变发生及进展为宫颈癌的病因，但并不是全部HPV持续感染的女性都会罹患宫颈癌，这表明在宫颈癌发病过程中尚存其他协同因素[4-5]。本研究通过采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和HPV DNA第2代杂交捕获((hybrid captureⅡ,HC-Ⅱ)法分别检测140例维吾尔族宫颈病变患者组织中血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)的RNA表达水平及HPV病毒载量，以明确VEGF-C在新疆维吾尔族妇女宫颈病变发生、发展中的作用，及VEGF-C的RNA表达水平与HPV载量的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年12月到2015年6月符合纳入标准的新疆医科大学附属肿瘤医院住院患者的病理标本。石蜡标本：慢性宫颈炎30例(作为正常对照组)、宫颈上皮内瘤变 (cervical intraepithelial neoplasia CIN) Ⅰ20例、CINⅡ 20例、CINⅢ20例、早期宫颈癌 50例并取同一患者治疗前的宫颈HPV(定量)标本。标本纳入标准：(1)所有患者均为维吾尔族妇女；(2)慢性宫颈炎标本均为子宫肌瘤行全子宫切除术后标本，均未合并任何宫颈疾病或其他影响试验结果的疾病；(3)CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ均为初治锥切大体标本；(4)早期宫颈癌FIGO 2009分期ⅠB1～ⅡA1期均为鳞癌术后大体标本，术前未经过辅助放化疗。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 RNAprep Pure FFPE Kit(DP439，天根，北京)；FastQuant RT Kit (KR106-02，天根，北京)；SYBR Select Master Mix (4472920，ABI，USA);梯度PCR仪(MyCycler Thermal Cycler,Bio-Rad,USA);Real-time PCR 仪器 (7500,ABI,USA)。

表1 宫颈病变与HPV载量相关性分析[n(%)]

1.2.2 总RNA抽提和cDNA合成 石蜡样品切成5～10 μm厚的片状，取出2～8张切片放置于1.5 mL RNase-Free离心管中，向离心管中加入1.0 mL二甲苯剧烈涡旋10 s，室温15～25 ℃，12 000 r/min 离心2 min。加入1.0 mL无水乙醇涡旋混匀，室温15～25 ℃，12 000 r/min 离心2 min。37 ℃放置10 min。加入200 μL裂解液RF，10 μL Proteinase K彻底涡旋混匀55 ℃孵育15 min，80 ℃孵育15 min，室温15～25 ℃，12 000 r/min离心5 min。加入220 μL的缓冲液RB，660 μL的无水乙醇，12 000 r/min 离心1 min。加入80 μL的DNase Ⅰ工作液，室温15 min。加入500 μL去蛋白液RW1，室温15～25 ℃，12 000 r/min 离心30～60 s。加入500 μL漂洗液RW，室温静置2 min，12 000 r/min离心30～60 s；室温15～25 ℃，12 000 r/min离心2 min。悬空滴加30～100 μL RNase-Free双蒸水(ddH2O)，室温12 000 r/min离心2 min，得到RNA溶液。核酸蛋白定量仪检测RNA浓度、A260/A280，电泳检测RNA完整性。RNA样本按照5×g DNA Buffer 2 μL、Total RNA、RNase-Free ddH2O补足到 10 μL配置好体系简短离心(42 ℃，孵育3 min)。 将反转录反应中的Mix(10×Frist-Strand Buffer 2 μL，RT Primer Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O补足到 10 μL)加入反应液混匀(42 ℃，15 min；95 ℃，孵育3 min)，得到的cDNA。

1.2.3 Real-time PCR检测 引物由欧易生物公司设计合成，反应体系：Forward primer (10 μmol/L)0.4 μL，Reverse primer(10 μmol/L) 0.4 μL，SYBRR Select Master Mix (2X) 10.0 μL，cDNA template 1.0 μL，RNase-Free water加至20.0 μL。上游引物：5′-GGC TGG CAA CAT AAC AGA GAA-3′，引物长度21 bp，下游引物： 5′-CCC CAC ATC TAT ACA CAC CTC C-3′， 引物长度22 bp。每个样品重复3次实验，通过观察样品扩增曲线和熔解曲线，了解实验情况。同时进行内参基因β-Actin检测。将标准品进行l0倍梯度稀释拷贝5个梯度后，进行Real-time PCR，将阳性梯度的模板浓度和对应的CT值进行标准曲线的计算，相对表达量=2-ΔΔCt。

1.2.4 高危型HPV的检测 手术前采用HC-Ⅱ法检测患者宫颈HPV载量。用专用HPV取样器,插入宫颈外口,顺/逆时针(同方向)转动5～8圈,取出后放入含有保存液的配套试管中，随后送至该院检验科进行检测。HPV试剂购于上海凯杰企业管理有限公司(Qiagen Gaithersburg,MD20878,Inc)。HC-Ⅱ检测样本中HPV-DNA水平。具体操作步骤由检验科的检验专业医师操作，按试剂盒说明的详细步骤进行检测。

2 结 果

2.1VEGF-C的表达 各组组织中VEGF-C基因的相对表达量不同，其中CINⅡ[(1.158±0.144)pg/mL]、CINⅢ[(2.161±0.288)pg/mL]及早期宫颈癌[(2.929±0.600)pg/mL]组织中VEGF-C水平比慢性宫颈炎[(1.009±0.135)pg/mL]组织明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；CINⅢ及早期宫颈癌组织中VEGF-C水平比CINⅠ[(1.071±0.124)pg/mL]、CINⅡ均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；早期宫颈癌组织中VEGF-C水平比慢性宫颈炎、CINⅠ～Ⅲ组织均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2HPV的感染情况HPV在慢性宫颈炎、CINⅠ～Ⅲ和早期宫颈癌中的感染情况(HPV载量大于1为感染)分别为 3/30(10%)、16/20(80%)、17/20(85%)、19/20(95%)和50/50(100%)，病变程度越高，HPV感染率亦明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1；HPV载量同宫颈病变程度有相关性，呈中度正相关(r=0.59，P<0.01)。

2.3VEGF-C和HPV载量的关系 经Spersman等级相关分析,VEGF-C在宫颈病变的表达水平与HPV载量有相关性，呈正相关(r=0.179，P=0.035)。

3 讨 论

3.1VEGF-C与宫颈病变的关系VEGF在目前已知的各种淋巴管内皮生长刺激因子中特异性最高，其中VEGF-C最为显著。VEGF-C是目前公认的淋巴管生成因子，可以导致淋巴管内皮细胞增殖、分化、迁移，在诱导肿瘤细胞的增殖及转移过程中起重要作用。有研究表明,VEGF-C在正常宫颈组织中不表达，在CINⅡ～Ⅲ及宫颈鳞癌组织中表达均增高[6]。Inamine等[7]研究证明，VEGF-C是宫颈癌变的早期标志物，并与CIN级别呈正相关。也有研究证明，VEGF-C可促进肿瘤直径增大、原发肿瘤进展，从而导致局部浸润、淋巴结远处转移，最终可在一定程度上影响肿瘤预后[8-10]。本研究结果显示，高级别宫颈病变(CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌)组织中VEGF-C水平比慢性宫颈炎组织明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；在慢性宫颈炎、CINⅠ～Ⅲ和宫颈癌发展过程中水平逐渐增高,在宫颈癌中最高，差异有统计学意义(P<0.05)。说明VEGF-C与维吾尔族宫颈癌发生、发展密切相关，可能在CIN发展为宫颈癌并继续进展转移过程中发挥一定作用，本研究与其他研究结果相符。

3.2HPV载量与宫颈病变的关系HPV主要侵犯皮肤和黏膜的上皮细胞。HPVE基因编码的蛋白具有多种调控功能，E6、E7是最重要的调控蛋白，可促使肿瘤发生、发展。研究已经确定，高危型HPV病毒的持续感染可以导致宫颈癌前病变发生并最终发展为宫颈癌。吕倩灵等[11]认为宫颈癌及其癌前病变的发生、发展与高危型HPV的感染及其病毒载量高低密切相关。高玉华等[12]针对各级别宫颈病变中HPV病毒载量的分布研究发现，HPV病毒载量与宫颈病变的严重程度具有密切相关性，HPV病毒较高载量的持续感染预示着宫颈高级别病变发生率增高。本研究的结果表明，维吾尔族各级别宫颈病变与慢性宫颈炎组织相比，HPV感染率明显升高，且宫颈HPV感染率与宫颈上皮细胞损伤严重程度呈正比，差异有统计学意义(r=0.59，P<0.01)。

3.3VEGF-C和HPV的关系HPV致癌机制尚不完全明确，目前关于HPV载量和VEGF-C相关性的研究尚不多见。Huang等[13]通过PCR的方法将HPV-16E6阳性的细胞同HPV-16E6阴性的比较，发现HPV的原癌基因可能通过直接作用于VEGF-C的基因启动子区促进肿瘤血管生成，提示VEGF-C的表达与HPV密切相关。还有研究进一步发现HPV-16E6原癌蛋白可以激活缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)，增强了VEGF-C的释放，同时，HPV-16E5的原癌蛋白还通过激活多条信号通路上调了VEGF-C的表达[14-16]。目前试验结果表明，HPV、VEGF-C在细胞周期调控之间可能存在着极其复杂的网络化的相互联系，二者在宫颈癌前病变及宫颈癌的发生、发展及肿瘤血管生成过程中发挥协同作用，因此认为HPV的免疫表达同VEGF-C的密度显著相关，HPV感染可能刺激了宫颈癌中肿瘤血管生成，这是HPV引发宫颈癌的重要机制之一。本研究结果显示，维吾尔族妇女各级别宫颈病变组织中VEGF-C表达水平和高危HPV载量呈正相关(r=0.18，P<0.01)，提示二者之间存在一定的内在联系，但相关性较弱。考虑可能为本研究样本量较小，需前瞻性大样本试验进一步证实维吾尔族患者HPV是否通过提高VEGF-C水平而导致恶性肿瘤发生、发展及播散。还有研究进一步发现HPV-16E6原癌蛋白可以激活HIF-1α，增强了VEGF-C的释放，同时，HPV-16E5的原癌蛋白还通过激活多条信号通路上调了VEGF-C的表达[12-14]。因此有理由认为HPV的免疫表达同VEGF-C的水平显著相关，HPV感染可能刺激了宫颈癌中肿瘤血管生成，这是HPV引发宫颈癌的重要机制之一。目前试验结果表明，HPV、VEGF-C在细胞周期调控之间可能存在着极其复杂的网络化的相互联系，二者在宫颈癌前病变及宫颈癌的发生、发展及肿瘤血管生成过程中发挥协同作用。

高危型HPV的感染可促进VEGF-C表达增加，进一步引起宫颈癌组织的血管生成，是宫颈癌发生、侵袭及转移的重要机制之一。但目前高危型HPV感染如何促进血管内皮生长因子C在肿瘤血管及淋巴管形成中的作用和具体机制尚不完全明确，需要进一步的研究，若明确其作用，则可以通过阻断该途经，从而防止CIN向宫颈癌发展。

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Correlation between the expression of VEGF-C and HPV load in cervical disease of Vighur population*

WangXinling1,LiZhaozhao1,Guzalnur·Abuliz2△，XiaMing3

(1.4thDepartmentofGynecologicSurgery，XinjiangMedicalAffiliatedTumorHospital，Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830011，China;2.5thDepartmentofGynecologicSurgery，XinjiangMedicalAffiliatedTumorHospital，Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830011，China;3.theFirstClinicalCollegeofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400046，China)

Objective To study the relations between the expression of VEGF-C and HPV load in cervical disease in Uighur population of Xinjiang.Methods A total of 140 cases including 30 cases of normal cervical tissues,60 cases of CINⅠ-Ⅲ and 50 cases of cervical cancer tissues were selected in this experiment.The expression of VEGF-C of all cases were detected by Real-time PCR assay;HPV load were detected by HC-Ⅱ before operation.And we compared the relationship between cervical lesions and these two index.Results VEGF-C and HPV load were both over-expressed in cervical cancer and CINⅡ-Ⅲ tissues,compared with normal cervical tissues(P<0.05).In cervical cancer samples and CIN samples,the expression level of VEGF-C and the degree of cervical diseases were positive associated with HPV load(P<0.05).Conclusion The expression level of VEGF-C and HPV load are both related to the degree of cervical lesions.

uterine cervical neoplasms；uterine cervical diseases；vascular endothelial growth factor；human pappilomavirus

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.002

新疆维吾尔自治区自然基金(2013211A071)。作者简介：王新玲(1966-)，主任医师，硕士，主要从事妇科肿瘤方面研究。△

Email：gzlnr@qq.com。

R

A

1671-8348(2016)23-3173-03

2016-04-15

2016-06-30)

*qq.com。