甲状腺功能亢进对大鼠肝脾铁含量及血红素加氧酶1表达的影响*

彭丁晋，李艳伟，黄作良，黄泽智，马新华，赵晋英

(邵阳市分子生物学诊断重点实验室/邵阳医学高等专科学校检验系，湖南邵阳 422000)



甲状腺功能亢进对大鼠肝脾铁含量及血红素加氧酶1表达的影响*

彭丁晋，李艳伟，黄作良，黄泽智，马新华，赵晋英△

(邵阳市分子生物学诊断重点实验室/邵阳医学高等专科学校检验系，湖南邵阳 422000)

目的 通过检测甲状腺功能亢进(简称甲亢)时大鼠肝、脾组织铁含量和血红素加氧酶1(HO-1)的表达，探讨甲亢对大鼠机体铁代谢的影响。方法 将18只雌性SD大鼠分为甲亢4周组、甲亢8周组和对照组，每组6只。甲亢组灌胃给药优甲乐，对照组灌胃生理盐水。造模结束分别取各组大鼠肝、脾脏，用二氨基联苯胺增强的Perl′s铁染色法检测肝、脾组织铁含量，用逆转录PCR技术检测大鼠肝、脾组织HO-1mRNA的表达；利用Westernblot和免疫组织化学染色法对大鼠肝、脾脏HO-1表达进行分析。结果 甲亢模型4周、8周组大鼠的肝、脾组织铁染色均明显强于对照组，且甲亢8周组强于甲亢4组(P<0.01)； 甲亢4周、8周组大鼠的肝、脾脏的HO-1mRNA、蛋白表达均高于对照组，且甲亢8周组明显高于4周组，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 甲亢可引起肝、脾组织铁含量增加，HO-1表达增强。

甲状腺素；血红素加氧酶-1；肝；甲状腺功能亢进；脾脏；铁含量

甲状腺功能亢进(后简称甲亢) 是甲状腺激素分泌增多导致的一种常见内分泌疾病。临床上，甲亢患者易发生贫血[1-2]。研究资料显示缺铁、铁利用障碍与甲亢性贫血的发生有关[3]。肝、脾脏是机体最主要的储铁器官，而且是衰老红细胞内铁再循环利用的主要场所，而血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)作为血红素铁再利用的限速酶，在肝脾铁稳态调节中发挥着非常重要的作用[4-5]。然而，目前甲亢对肝脾铁代谢及HO-1影响相关的研究鲜见报道。因此，本实验通过检测甲亢模型大鼠肝脾铁含量及HO-1的表达，进一步探讨甲亢对肝脾铁代谢的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物 优甲乐片即左旋甲状腺素钠购自德国默克公司(批号：169818)。

1.1.2 实验动物 SPF级健康雌性SD大鼠18只，由南华大学实验动物中心提供，体质量(200±10)g，在室温18～25 ℃，50%～70%相对湿度条件饲养。

1.1.3 实验试剂及仪器 Trizol、 逆转录PCR(RT-PCR)试剂盒购自碧云天生物公司；辣根酶标记羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、羊抗小鼠IgG、兔抗大鼠HO-1抗体、羊抗兔链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex,SABC)检测试剂盒均购自武汉博士德生物公司；β-actin抗体购自Abcam公司；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和HO-1引物购于上海生物工程公司；PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 实验甲亢模型分组、造模及取材 18只雌性SD大鼠分为甲亢4周组、甲亢8周组和对照组，每组6只。参照张彬等[6]的方法造模：研磨优甲乐片，用生理盐水混悬，灌胃给药(60 μg/100 g，1次/天)；对照组灌服生理盐水。两个甲亢组大鼠分别于第4周和第8周末处死，对照组于实验末处死。取大鼠肝脾组织，部分石蜡包埋切片(4 μm厚)，其余新鲜肝脾组织经提取总RNA，行RT-PCR实验；经提取总蛋白，行Western blot 实验。

1.2.2 二氨基联苯胺(DAB)增强的Perl′s铁染色 肝、脾组织切片脱蜡复水，置于现配的5%氯化氢(HCl)-5%亚铁氰化钾1∶1混合液中30 min；磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，3%H2O2去除内源性过氧化物酶；DAB显色，苏木素复染细胞核以利于镜下观察，封片镜检。同行做阴性对照染色，除了不加HCl-亚铁氰化钾混合液外，其余步骤相同。组织铁阳性染色呈棕黄色颗粒状。

1.2.3 RT-PCR检测 用Trizol提取肝、脾组织总RNA。以GAPDH为内参，采用RT-PCR 两步法检测大鼠HO-1 mRNA的表达，大鼠HO-1上游引物序列为5′-CAG AAC CCA GTC TAT GCC-3′，下游序列为 5′-GCT CGG GAA GGT GAA AA-3′，扩增长度306 bp；大鼠GAPDH上游序列为5′-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3′，下游序列为5′-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3′，扩增长度 308 bp。PCR反应条件：第1步95 ℃ 4 min，1个循环；第2步94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s (50 ℃ for GAPDH)，72 ℃ 30 s，共30 个循环；第3步72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳约1 h(电压150 V)，经 Photoshop 软件测定条带亮度值，将扩增目标产物与内参相比进行相对定量。

1.2.4 Western blot检测 用Western blot检测大鼠肝、脾脏HO-1的表达情况。大鼠新鲜肝、脾组织经匀浆裂解后， 4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清液，采用蛋白质定量试剂盒(BCA)测定实验样品蛋白浓度。取含有30 μg蛋白量的上样体积进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，将胶上蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%牛血清清蛋白(BSA)封闭2 h，加入兔抗大鼠HO-1抗体(1∶100)， 4 ℃过夜孵育后，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1∶1 000)37 ℃孵育2 h，最后滴加超敏电化学发光(ECL)发光液孵育，X胶片曝光，每步反应期间用磷酸盐缓冲液(PBST)充分洗涤3次，每次5 min。以β-actin为内参，一抗为小鼠抗大鼠β-actin抗体(1∶1 000)，二抗为辣根酶标记的羊抗小鼠IgG(1∶1 000)。曝光胶片分别分析条带灰度值，以HO-1及β-actin灰度值之比进行相对定量。

1.2.5 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SABC法对肝、脾HO-1进行定位。一抗为兔抗大鼠HO-1抗体(1∶100)，操作严格按照SABC检测试剂盒说明书进行，阴性对照用PBS代替一抗。结果判断：HO-1定位于细胞质内，染色呈棕黄色部位。

2 结 果

2.1 甲亢对大鼠肝、脾铁含量的影响 经DAB增强的Perl′s染色法，组织铁镜下呈棕黄色染色，分布于细胞质和(或)细胞间质。对照组大鼠肝细胞和肝巨噬细胞铁染色明显，在中央静脉周围染色更甚(图1A)，而门管区染色较浅。对照组脾组织铁染色颗粒主要位于红髓，白髓无明显铁染色颗粒(图1D)。而甲亢4周组和8周组大鼠肝、脾组织铁染色均明显强于对照组，且甲亢8周组肝、脾组织铁染色强于甲亢4周组，见图1B、C、E、F。

图1 大鼠肝脏和脾脏DAB增强的Perl′s铁染色(×100)

2.2 甲亢对肝、脾HO-1mRNA表达的影响RT-PCR显示，大鼠肝、脾组织均表达HO-1mRNA。甲亢4周组和8周组肝、脾组织的HO-1mRNA表达均高于对照组，且甲亢8周组肝、脾组织的HO-1mRNA表达又明显高于甲亢4周组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图2～3。

图2 RT-PCR检测肝脏HO-1 mRNA的表达

图3 RT-PCR检测脾脏HO-1 mRNA的表达

2.3 甲亢对肝、脾HO-1蛋白表达的影响 经Westernblot结果显示，大鼠肝、脾组织均表达HO-1蛋白。甲亢4周组和8周组肝、脾组织HO-1蛋白表达均高于对照组，且甲亢8周组明显高于甲亢4周组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图4～5。免疫组织化学染色结果显示，对照组大鼠肝组织HO-1蛋白主要定位于肝巨噬细胞，肝细胞无明显染色，脾组织HO-1蛋白主要定位红髓，白髓无明显染色。甲亢4周组和8周组肝、脾组织HO-1染色均强于对照组，且甲亢8周组明显强于甲亢4周组，见图6。

图4 Western Blot检测肝脏HO-1蛋白的表达

图5 Western Blot检测脾脏HO-1蛋白的表达

图6 大鼠肝脏和脾脏HO-1免疫组织化学染色(×100)

3 讨 论

临床研究显示甲亢患者发生贫血的发病率国外约为8%～57%，国内10～44%，甲亢性贫血与机体铁代谢异常有关[3]。人体所需铁除了部分来源于食物，大部分则来源于衰老红细胞中血红素铁的再循环。肝、脾不仅是机体最主要的储铁器官，而且是衰老红细胞内铁再循环利用的主要场所，因此肝、脾在机体铁稳态调节中处于重要的地位。本研究采用DAB增强的Perl′s铁染色检测了甲亢时肝、脾铁染色的变化[7]。实验发现大鼠肝组织铁主要位于肝细胞和肝巨噬细胞，在近中央静脉处染色明显，而门管区染色较弱。脾组织铁染色颗粒主要位于红髓。而甲亢模型大鼠的肝、脾组织铁染色均明显强于对照组，且随时间延长逐渐增强，提示机体在甲亢时肝、脾组织铁储量明显高于正常状态。

铁在机体发挥重要的作用，但过多的铁可诱导自由基的生成，通过氧化应激反应损害组织器官[8]。临床报道甲亢伴有肝损害的并不少见[9]，本实验发现的甲亢大鼠肝组织铁含量升高可能参与了甲亢性肝损害。当胞内铁含量过多时，细胞一般通过增加铁储存蛋白，即铁蛋白(Feritin，Fn)的表达来结合过多的铁。有临床资料显示甲亢患者血清中Fn水平升高，动物实验也证实甲亢可引起肝组织Fn表达升高[10]。可以这样认为，甲亢引起了肝脾的铁含量升高，同时诱导肝脾Fn表达结合过多的铁，Fn的升高对器官起保护作用，而过多的Fn从细胞溢出血液引起了血液中Fn水平的升高。

甲亢大鼠肝、脾组织铁含量升高，提示甲亢时单核巨噬细胞对衰老红细胞的破坏有可能高于正常生理状态，使得血红素铁的再循环增加。脾脏巨噬细胞吞噬衰老的红细胞分解血红蛋白释放出血红素，HO可催化血红素降解产生胆绿素、CO和Fe2+。另外，10%～20%的衰老红细胞也会在血管内发生破裂，释放出的血红蛋白与结合珠蛋白结合，然后被运输到肝脏，在肝细胞形成内吞小体，分解出血红素，血红素再经HO作用释放出Fe2+[11]。HO是血红素分解代谢的限速酶，血红素铁的再循环与肝脾HO的表达量有关。

哺乳动物体内存在3种形式的HO：HO-1、HO-2和HO-3。在非应激状态，肝细胞主要表达HO-2，HO-1只在Kupffer细胞中分布；在应激性伤害时，肝组织HO活性的主要成分是HO-1，不仅分布于Kupffer细胞，也可表达在肝实质细胞和间质细胞中[12]。在脾中HO-1的表达量是HO-2的5倍[13]。HO-1是诱导型HO，诸如重金属、血红素、缺氧、化学物质、细胞因子等均可诱导HO-1的表达增加[14]。而目前认为只有糖皮质激素能调节HO-2的表达,HO-3的表达量极少，其分解血红素的活性亦最低。因此，本实验仅检测了甲亢模型大鼠肝、脾组织HO-1的表达。

RT-PCR和WesternBlot结果显示，大鼠肝、脾组织均表达HO-1mRNA及蛋白。甲亢组HO-1mRNA及蛋白各时间点表达均高于对照组，且随时间延长逐渐升高。免疫组织化学染色结果显示，对照组大鼠肝脏HO-1蛋白主要定位在肝巨噬细胞，肝细胞无明显染色。而脾脏HO-1蛋白主要定位红髓，白髓无明显染色。脾组织红髓含有大量的巨噬细胞，这也提示脾脏中主要是巨噬细胞表达HO-1。本研究中甲亢模型鼠肝、脾HO-1表达增强的结果提示肝脾对血红素的分解代谢活动增强，使得衰老红细胞血红素铁再循环增强，这可能是甲亢肝、脾铁储量增加的原因。

另外，资料显示HO-1也是机体内最易被诱导产生的抗氧化酶类，缺血再灌注等多种损害因素均可诱导肝组织HO-1活性增加[15]，而HO-1对由氧化应激损害引起的细胞损伤也具有保护作用[16]。由于甲亢促进了机体新陈代谢，产热增加，耗氧量增加，这可能引起器官氧自由基增加，氧化应激反应增强。甲亢时肝、脾组织HO-1表达增加也可能是机体应对高氧化应激反应的一种细胞保护反应。细胞中游离血红素是一种促氧化剂，当血红素与分子氧反应时，可催化产生活性氧簇(ROS)，而HO-1可催化血红素降解产生胆绿素、CO和Fe2+，避免对细胞的损伤；铁离子亦能诱导Fn的表达，结合催化氧自由基形成所需要的游离铁，从而减轻氧自由基对组织细胞的损伤；胆绿素和胆红素不仅具有抗氧化特性，二者还能通过其他途径发挥细胞保护作用[17-18]。

总之，本实验发现甲亢可引起肝、脾组织铁含量增加，HO-1表达增强。增加的铁含量有可能是由于衰老红细胞血红素铁再循环增加所致，而HO-1表达增强促进了血红素铁的释放，增高的HO-1对肝、脾等重要脏器也可能具有保护作用。

虽然本实验未探讨甲亢时是否红细胞破坏增加，但有资料显示甲亢时心肌收缩力增强，心率加快，血液循环加快。高速血流可引起血管内红细胞破坏增加，加快红细胞衰老速度。另外，甲亢时骨髓红细胞异常生成，幼红细胞数量偏高，但由于存在某种铁利用障碍，而形成一定程度的无效红细胞生成。另外，亦有观点认为血红蛋白具有甲状腺激素的结合位点，结合甲状腺激素的多少可以反映血红蛋白的寿命，甲亢患者高含量的甲状腺激素也必然导致红细胞的寿命缩短。同时动物实验也发现甲亢大鼠红细胞的渗透脆性明显下降[19]。总之，这些因素均有可能增加了肝脾内巨噬细胞对红细胞的过滤，加快血红素铁在肝脾的再循环，促进肝脾铁储量的增加。因此，本研究结果提示临床上治疗甲亢性贫血时，须慎用补铁疗法，以免加重机体铁超载负担，增加肝脏等重要器官的氧化应激损伤。然而，由于动物实验采用的甲亢造模方法与临床上甲亢患病的机制有一定区别，本研究结果仍需在临床上进一步研究证实。

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《重庆医学》编辑部

The effects of hyperthyroidism on Iron content and heme oxygenase 1 expression of liver and spleen of rats*

PengDingjin,LiYanwei,HuangZuoliang,HuangZezhi,MaXinhua,ZhaoJinying△

(ShaoyangKeyLaboratoryofMolecularBiologyDiagnosis/theDepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,ShaoyangMedicalCollege,Shaoyang,Hunan422000，China)

Objective To explore the effects of hyperthyroidism on Iron content and heme oxygenase 1(HO-1) expression of liver and spleen of rats.Methods A total of 18 female SD rats were divided into hyperthyroidism for 4 weeks group(n=6),hyperthyroidism for 8 weeks group(n=6) and control group(n=6).Hyperthyroidism rats were induced by intragastric administration of Euthyrox (Levothyroxine).And the control rats were given normal saline.The liver and spleen of rats were obtained after administration,respectively.Iron of liver and spleen were stained by DAB enhanced Perls′ method,and the expression of HO-1 mRNA was measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).HO-1 protein was measured by Western blot and immunohistochemistry.Results Iron staining of liver and spleen of hyperthyroidism for 4 weeks group and 8 weeks group was significantly stronger than those of control group,respectively.And Iron staining of liver and spleen of hyperthyroidism for 8 weeks group was stronger than those of hyperthyroidism for 4 weeks group.The increase of HO-1 mRNA and protein expression was shown in liver and spleen of hyperthyroidism for 4 weeks group and 8 weeks group (P<0.01).Moreover,the expression of HO-1 mRNA and protein of liver and spleen of hyperthyroidism rats for 8 weeks group were higher than those of hyperthyroidism for 4 weeks group(P<0.01).Conclusion The hyperthyroidism induced increase of Iron content，HO-1 mRNA and protein expression of liver and spleen of rats.

thyroxine；heme oxygenase-1；liver;hyperthyroidism；spleen；Iron content

2013年湖南省教育厅科学研究优秀青年项目(13B157)。 作者简介：彭丁晋(1981-)，讲师，硕士，主要从事甲状腺功能亢进对机体铁代谢的影响方面研究。△

E-mail：zhaojinying928@163.com。

论著·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.010

R

A

1671-8348(2016)23-3196-05

2016-04-24

2016-06-23)