以羊膜为载体体外培养大鼠角膜缘干细胞的实验研究*

胡 蓉，高 杰，梁雅茹，黄 悦，李 红，苏 敏

(贵州医科大学组织学与胚胎学教研室，贵阳 550004)



·技术与方法·

以羊膜为载体体外培养大鼠角膜缘干细胞的实验研究*

胡 蓉，高 杰，梁雅茹，黄 悦，李 红，苏 敏△

(贵州医科大学组织学与胚胎学教研室，贵阳 550004)

目的 比较角膜缘干细胞(LSCs)在不同羊膜上的生长情况，寻求LSCs体外培养的最佳载体。方法 取健康剖宫产孕妇胎盘的羊膜组织，分别制备保留上皮的新鲜羊膜、去除上皮的新鲜羊膜和冷冻羊膜。消化法分离大鼠LSCs后将其按相同浓度分别种植于3种事先准备好的羊膜载体和无载体孔中，分为4组。实验1组：保留上皮的新鲜羊膜组；实验2组：去除上皮的新鲜羊膜组；实验3组：去除上皮的冷冻羊膜组；对照组：无羊膜载体组。4组细胞分别作细胞凋亡检测，p63、PCNA免疫荧光检测，检测阳性细胞计数。结果 培养第3天，3个实验组培养的细胞排列紧密，融合形成单层，其中可见大小不等的团块状集落，细胞大小基本一致，多呈圆球形或卵圆形。对照组培养的细胞排列相对稀疏，基本融合，形成单层，可见散在的、大小不等的桑葚样细胞集落，集落细胞的生长特征及形态特点与实验组相似。实验组的细胞凋亡率均低于对照组，p63阳性率和PCNA阳性率均高于对照组(P<0.01)，尤以实验1组变化最为明显(P<0.01)。结论 羊膜载体有利于体外培养大鼠LSCs的扩增，保留上皮的新鲜羊膜能更好地维持体外培养LSCs的特性，是体外角膜缘干细胞培养的理想载体。

角膜缘；干细胞；羊膜；染色与标记；角膜；细胞凋亡；p63；PCNA

正常角膜表面由角膜上皮细胞覆盖，表层上皮细胞不断脱落死亡，同时基底层的细胞不断增殖以取代表层上皮细胞。角膜上皮的完整性依赖于这一动态平衡过程。体外培养的角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)移植被认为是目前针对眼表疾病最有前景的治疗方法之一[1-3]。大量实验表明羊膜是LSCs体外培养的良好底物，是干细胞体外培养和临床移植研究的首选载体[4-6]。卢建民等[7]研究报道，将人羊膜上皮细胞移植到兔角膜缘干细胞缺乏性功能障碍(LSCD)模型眼上可抑制新生血管，减轻角膜混浊。以羊膜为载体的LSCs体外培养方法的建立，目前主要集中在新鲜羊膜或低温冷冻保存羊膜的使用。对于何种羊膜载体在LSCs培养中更有利于LSCs的生长目前尚需进一步研究。故本研究拟探讨用不同羊膜为载体体外培养LSCs的方法，比较LSCs在不同羊膜上的生长情况，以期寻求LSCs体外培养的最佳载体，为最终实现以体外培养的LSCs移植提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 健康清洁级SD大鼠，体质量200～500 g，雌雄不限，由贵州医科大学实验动物中心提供，生产许可证：SCXK(黔)2012-0001。孕妇胎盘，产前进行母体血清学检查，排除一切传染性疾病的感染，由贵州医科大学附属医院提供，并通过伦理委员会批准。

1.1.2 仪器与试剂 DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司，0.25%Trypsin-0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)购自美国Hyclone公司，兔多克隆抗体p63购自北京博奥森生物技术公司，小鼠单克隆抗体PCNA、细胞凋亡检测试剂盒、免疫荧光试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，细胞培养板购自美国Costar公司，CO2培养箱购自美国Thermo公司，倒置相差显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 羊膜载体的制备 取行剖宫产的健康孕妇的胎盘，无菌条件下，钝性分离获取羊膜，浸泡在含青链霉混合液(1∶1)的磷酸盐缓冲液(PBS)中20 min。上皮面向上贴附于无菌硝酸纤维素膜上，修剪成2.5 cm×2.5 cm的小块。(1)羊膜保存：将部分羊膜置于5%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液中浸泡备用，4 ℃保存，于取材后12 h内使用。将剩余羊膜按培养基和甘油1∶1混合的溶液浸泡，4 ℃冰箱中放置20 min，转-80 ℃冰箱保存2个月，待使用时取出迅速置于37 ℃ PBS中解冻1 min，冲去表面甘油，PBS水化30 min后去上皮。(2)羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶、0.01%EDTA的消化液37 ℃消化45 min，细胞刮刀刮除上皮细胞，倒置镜下确认上皮细胞全部清除，上皮面朝上置于24孔培养板内于37 ℃孵箱中干燥待用。

1.2.2 LSCs的分离与培养 取新鲜大鼠角膜缘组织，眼科剪将组织反复剪碎至1 mm2大小，消化液37 ℃消化20 min，加适量20%胎牛血清的DMEM/F12培养基反复吹打至单细胞悬液，离心去上清液。适量培养液重悬细胞，计数后以1.5×105/cm2的密度分别接种于平铺24孔培养板中，分为4组：有新鲜的保留上皮的羊膜为实验1组；新鲜的去除上皮的羊膜为实验2组；经冷冻保存的去除上皮的羊膜及无羊膜载体的为实验3组；无羊膜载体组为对照组。37 ℃ 5%CO2培养，培养液每2～3天更换1次，每日用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况并拍照记录。

1.2.3 细胞凋亡苏木素-伊红(HE)染色检测 取分组培养第5天的LSCs，按照武汉博士德生物工程有限公司提供凋亡检测试剂盒说明书操作。

1.2.4 免疫荧光细胞化学染色检测 取分组培养第5天的LSCs，免疫荧光细胞化学染色检测p63和PCNA的表达。实验严格按照说明书操作，空白对照以PBS代替一抗。

2 结 果

2.1 羊膜载体的制备 倒置显微镜观察，保留上皮的羊膜上皮细胞呈立方形，小而密，覆盖整个表面(图1A)。去除上皮的羊膜表面未见细胞成分，可见基底膜网状纤维，纵横交错，见图1B。

图1 羊膜载体制备结果(×200)

图2 SD大鼠LSCs体外细胞培养结果(×400)

2.2 大鼠LSCs的培养体外生长特征 倒置镜观察，培养第3天，实验1组(图2A)、实验2组(图2B)、实验3组(图2C)3个实验组培养细胞排列紧密，融合形成单层，单层之间可见大小不等的团块状集落，细胞大小基本一致，多呈圆球形或卵圆形，其中实验2组和实验3组的细胞集落均多于实验1组的细胞集落，但二者的死细胞数比实验1组多。对照组(图2D)培养细胞排列相对稀疏，基本融合形成单层，可见散在的、大小不等的桑葚样细胞集落，集落细胞生长特征及形态特点与实验组相似，死细胞明显比3个实验组的死细胞多。HE染色观察4组培养细胞的形态特征：实验1组(图2E)、实验2组(图2F)、实验3组(图2G)3个实验组的LSCs数量均相对较多，对照组(图2H)细胞数较少，4组培养细胞的形态基本相同，均呈椭圆形或不规则形。

2.3 免疫荧光细胞化学检测各组p63蛋白及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达 培养第5天，3个实验组中均有大多数细胞呈p63阳性反应(细胞核发出橙黄色荧光的细胞则为p63阳性细胞)，而p63阳性细胞则为LSCs。实验1组、实验2组、实验3组的p63阳性率均高于对照组(图3)。细胞核发出橙黄色荧光的细胞则为PCNA阳性细胞，3个实验组中均有大多数细胞呈PCNA阳性反应。实验1组、实验2组、实验3组的PCNA阳性率均高于对照组(图4)。实验1组与实验2组的p63，PCNA阳性性表达率比较，差异有统计意义(P<0.01)；实验1组与实验3组的p63，PCNA阳性性表达率比较，差异有统计意义(P<0.01)；实验2组与实验3组的p63，PCNA阳性性表达率比较，差异无统计意义(P>0.05)，见图3、4。

图3 SD大鼠LSCs中p63免疫荧光染色结果

2.4 细胞凋亡检测各组细胞的凋亡率 培养第5天，3个实验组中均有少数细胞呈细胞凋亡阳性反应，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性，即发生凋亡的细胞。实验1组细胞凋亡率为(21.63±2.76)%、实验2组细胞凋亡率为(31.21±2.50)%、实验3组细胞凋亡率为(30.49±4.01)%，而对照组细胞凋亡率为(54.60±5.21)%。与对照组比较，实验1组、实验2组、实验3组均细胞凋亡数量减少(P<0.01)。实验3组与实验2组细胞凋亡率均高于实验1组，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5。

图4 SD大鼠LSCs中PCNA免疫荧光染色结果

图5 SD大鼠LSCs细胞凋亡结果

3 讨 论

3.1 大鼠LSCs的体外培养及鉴定LSCs位于角膜缘上皮基底层中，其更新能够保持角膜缘上皮细胞功能和结构的完整性，对于角膜通透性至关重要。因此LSCs体外培养及相关分子鉴定至关重要。直到目前为止，关于LSCs的鉴定都是间接的。Sudha等[8]发现，p63局限地位于角膜上皮边缘的基底细胞，认为p63是LSCs的标志物。Parthasarathy等[9]研究发现p63在LSCs中高表达，而在由干细胞分化而来的短暂扩充细胞中不表达，认为p63可作为鉴定LSCs的标志。近年来，p63已被广泛用作了LSCs的鉴定[10-13]。

PCNA是一种在增殖细胞中合成和表达的核内多肽，它的表达和合成与细胞周期有关，其作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与了细胞的增殖能力，在含有增殖细胞的组织中，PCNA呈阳性表达，故PCNA可间接地反映细胞的增殖状况[14]。PCNA阳性细胞仅局限于有增殖能力的组织，是评价细胞增殖能力的可靠指标，多用于细胞的体外培养[15]。故本研究对4组细胞进行了PCNA免疫荧光细胞化学染色，各组中均有不同数量的细胞染色呈阳性，证明了所培养的LSCs具有较强的增殖能力。

3.2 最佳羊膜载体的选择 目前认为，羊膜是干细胞体外培养和临床移植研究的首选载体[4]。Bourne将正常人羊膜组织自内向外分为5层：(1)上皮细胞层；(2)基底膜；(3)致密层；(4)纤维母细胞层；(5)海绵层。在制备羊膜载体时，将绒毛膜去掉，合格的羊膜载体只包括上皮细胞层和基底膜，无血管和基质成分(如成纤维细胞、胶原和其他非细胞成分)。本实验制备的羊膜载体成分均符合体外培养载体的要求。

本研究在3种羊膜上培养的LSCs发现所得的克隆细胞团形态一致，有较高的核质比，说明3种培养方法均较好地保持了培养LSCs的干细胞特性。倒置镜观察到，羊膜载体上培养的细胞，3d的融合率可达到70%，5d可达100%，明显高于无载体组(第5天左右方可达到70%的融合)，说明在3种羊膜载体上培养的大鼠LSCs生长速度快，克隆形成率高，具有较强的增殖能力，均较无载体状态更有利于LSCs的体外培养。

目前，关于新鲜羊膜和保存羊膜用于眼表疾病的治疗中孰优孰劣的问题，众说纷纭。LSCs在体内增殖分化受神经、内分泌、体液及微环境等各种因素的影响，其中各种细胞因子的作用尤为重要。许多研究表明，完整新鲜羊膜的上皮层细胞能够分泌多种生物活性分子(表皮生长因子、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等)，在体外培养时，能刺激培养细胞的增殖、运动，增强黏附，并调节其分化状态[16-20]。另外，神经生长因子还可诱导蛋白质合成、刺激免疫球蛋白M(IgM)分泌、调节胆碱乙酰基转移酶的活性,对调节LSCs生存的微环境，促进其增殖具有重要作用。本研究用新鲜完整羊膜培养的LSCs数量最多，增殖能力最强，细胞凋亡率最低，在整个培养过程中，除培养基外，未使用其他任何促进细胞增殖的试剂，产生这一结果的原因可能与羊膜上皮细胞分泌各种细胞因子，最好地模拟了LSCs生长的微环境有关。

羊膜的基底膜是人体中最厚的基底膜，含有Ⅳ型胶原纤维网(ColⅣ)、层粘连蛋白(LN)和硫肝糖蛋白，可以为细胞黏附提供支架，引发细胞内信号转导，促进细胞增生和移行[21]。说明去上皮的羊膜作为“移植的基底膜”，也可以为LSCs生长提供一种健康基质，起到增强LSCs的黏附，促进其移行和分化，以及防止凋亡等作用。故本研究用新鲜去上皮的羊膜作LSCs的体外培养，所获细胞的数量、增殖能力、凋亡率均优于无载体，提示在羊膜去上皮的情况下，羊膜基质在LSCs体外培养过程中也在一定程度上发挥了正面的作用。

针对冷冻去上皮羊膜培养LSCs的情况，研究表明，冷冻保存的羊膜中上皮分泌的各种细胞因子效价显著降低，但基底膜中含有的ColⅣ和LN并无明显变化，故认为在冷冻保存羊膜中各种生物活性分子的作用很小，甚至没有作用，而发挥主要作用的是基底膜[21]。这一观点支持了本实验冷冻去上皮羊膜组LSCs体外培养的结果，即由于没有羊膜上皮所分泌的各种细胞因子的作用，所获LSCs的数量、增殖能力均低于新鲜保留上皮的羊膜组，而凋亡率则相对增加；相关指标与新鲜去上皮羊膜组没有明显的区别，这也是没有设置冷冻保留上皮羊膜组培养的原因。

综上所述，本研究通过比较大鼠LSCs在保留上皮的新鲜羊膜、去除上皮的新鲜羊膜和去除上皮的冷冻羊膜上的生长情况和生物学特性发现，保留上皮的新鲜羊膜能更好地维持体外培养LSCs的干细胞的特性。因此，可认为保留上皮的新鲜羊膜载体更有利于大鼠LSCs的体外培养，是体外培养大鼠LSCs的理想载体，可为建立稳定的LSCs体外实验细胞模型，和LSCs进一步用于角膜损伤修复的研究奠定理论基础。

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An experimental study of cultivating rat limbal stem cells in vitro on amniotic membrane*

HuRong,GaoJie,LiangYaru,HuangYue,LiHong,SuMin△

(DepartmentofHistologyandEmbryology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To search the optimal substrate of limbal stem cells(LSCs) cultured in vitro and provide experimental basis for LSCs transplantation.Methods The amniotic membranes of placenta from healthy pregnant women were obtained after caesarean section,the intact fresh amniotic membrane,the denuded fresh amniotic membrane and the denuded frozen amniotic membrane were prepared.There were 4 groups in the experiment:the experimental group 1 (the intact fresh amniotic membrane group),the experimental group 2 (the denuded fresh amniotic membrane group),the experimental group 3 (the denuded frozen amniotic membrane group) and the control group (the amniotic membrane free group).One hundred and twenty SD rats were used in this experiment.The cells of 4 groups were detected by cell apoptosis(TUNEL method),immunofluorescence of p63 and PCNA.The positive rates were analysed with the statistical methods.Results On the 3th day,the cultured cells of 3 experimental groups spreaded tightly and fused to a monolayer.There were many big clones clustered and the cells were spherical or oval with the same size.The cultured cells of the control group spreaded less tightly and fused to a monolayer as well.There were some small clones clustered and the cells were similar to the experimental groups.Experimental groups had less apoptosis positive cells and most cells were p63 and PCNA positive,while the control group had more apoptosis positive cells and less p63 and PCNA positive cells.The cell apoptosis rates of three experimental groups were lower than those of control group,the positive rates of their p63 and PCNA were higher than those of control group (P<0.01).The changes of the experimental group 1 were the most obvious (P<0.01).Conclusion Three different amniotic membranes are all helpful for rat LSCs culture in vitro.Moreover，the cells cultured on the intact fresh amniotic membrane were maintained with better characteristics.So the intact fresh amniotic membrane is considered to be the optimal substrate.

limbus corneae；stem cells；amnion；staining and labeling;corneae；cell apoptosis;p63;PCNA

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目(黔省专合字[2012]41号)；贵州省科技厅-贵阳医学院联合基金(黔科合LG字[2012]026号)。 作者简介：胡蓉(1980-)，副教授，博士，主要从事干细胞基础与应用方面研究。△

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.023

R329.2

A

1671-8348(2016)23-3233-04

2016-04-08

2016-07-21)