机械力刺激对人肺泡上皮A549细胞JNK蛋白表达的影响*

胡晓波，张优仪，程德云

(1.四川省成都市第一人民医院呼吸内科 610041；2.四川省人民医院放射科，成都 610041；3.四川大学华西医院呼吸内科，成都 610041)



论著·基础研究

机械力刺激对人肺泡上皮A549细胞JNK蛋白表达的影响*

胡晓波1，张优仪2，程德云3△

(1.四川省成都市第一人民医院呼吸内科 610041；2.四川省人民医院放射科，成都 610041；3.四川大学华西医院呼吸内科，成都 610041)

目的 探讨机械力刺激对人肺泡上皮A549细胞c-Jun氨基末端激酶/促分裂原活化蛋白激酶 (JNK/MAPK)表达的影响。方法 建立离体的A549细胞机械刺激模型：分别以大小为1 000μstrain的张应力或压应力刺激细胞，在刺激前和刺激后0、5、15、30、60min时间点进行观察，共10组，每组3皿细胞。采用Westernblot检测机械刺激后细胞内磷酸化JNK/MAPK蛋白、总JNK/MAPK蛋白的表达变化。结果A549细胞经机械力刺激后，磷酸化JNK/MAPK蛋白水平增加。张应力组在30min时间点增加最明显，压应力组在15min时间点最明显。之后随着机械刺激时间延长，张应力和压应力刺激组的磷酸化JNK蛋白水平均出现下降，在60min时下降至基线水平。结论 1 000μstrain张应力或压应力刺激，均激活A549细胞JNK/MAPK，提示JNK通路可能参与了机械力诱导的A549细胞信号转导。

肺泡；蛋白质类；机械力；A549；JNK/MAPK；张应力；压应力

呼吸机诱导的肺损伤是机械通气最直接的危害。为了提高机械通气救治率，减少患者死亡，众多研究试图阐明呼吸机诱导肺损伤的相关机制[1-5]。国外研究发现机械力可引起肺上皮细胞释放炎症介质，产生活性氧簇，引起细胞增殖，导致细胞骨架蛋白改变等[6-9]，而国内鲜有这方面的报道。c-Jun氨基末端激酶/促分裂原活化蛋白激酶 (JNK/MAPK)是有丝分裂原活化蛋白酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中重要的信号传导因子，是否参与了肺细胞力信号的转导并不清楚。因此，本课题组在前期研究基础上[10-11]，观察机械力刺激人肺泡上皮A549细胞JNK/MAPK蛋白的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料 A549细胞株(美国标准生物品收藏中心)；DMEM细胞培养基和10%的小牛血清(美国GIBCO公司)；聚氟乙烯膜(PVDF膜，美国Millipore公司)；兔抗人JNK多克隆抗体、兔抗人磷酸化JNK抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体(美国Cell signaling公司)；蛋白定量试剂盒、发光底物试剂盒(美国Pierce公司)；4点弯曲细胞力学加载仪(成都电子科技大学研制)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将A549细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中，置于CO2孵箱(37 ℃，5%CO2，95%空气)。当细胞生长密度约80%时，用胰酶消化传代。按2×105/L的细胞密度接种于加力板上，然后放入培养皿，于孵箱中继续培养24～48 h。加力前用无血清培养基孵育细胞过夜，使细胞同步化。

1.2.2 试验分组 根据机械力的不同，试验分张应力试验和压应力试验。张应力试验设0、5、15、30、60 min刺激共5组。压应力试验设0、5、15、30、60 min 刺激也是5组。每组3皿细胞。

1.2.3 建立离体细胞刺激力学模型 分别以大小为1 000 μstrain 的张应力和压应力刺激A549细胞，在刺激后5、15、30、60 min时间点进行观察；0 min刺激组行伪暴露。

1.2.4 Western blot法检测蛋白表达 按文献[10-11]方法提取细胞总蛋白、蛋白定量，Western blot法检测蛋白表达。弃上清液，加入细胞裂解液后再用超声裂解仪破碎，4 ℃低温离心分装样本，然后蛋白浓度测定。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，上样前加变性剂。电泳完毕后切胶，蛋白电泳转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，过夜。以三羟甲基氨基甲烷(TBST)缓冲液漂洗，加一抗1∶1 000，37 ℃孵育1 h，如前漂洗。再加入辣根过氧化酶标记的二抗(抗兔1∶5 000)，再孵育60 min，再TBST漂洗3次。加入显色剂，暗室曝光，见到显色后终止反应，清水冲洗。用Bio-Image分析系统对条带灰度值测定。

2 结 果

0 min时经机械应力伪刺激有低水平的JNK磷酸化阳性反应，张应力组0 min时为0.56±0.12，压应力组0 min时0.62±0.22。随着应力刺激开始，JNK/MAPK蛋白磷酸化出现变化趋势。张应力刺激5 min时为0.71±0.17，JNK/MAPK蛋白磷酸化表达增多，但和0 min时间点相比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着时间的延长，JNK/MAPK蛋白磷酸化表达呈上升趋势。张应力组15 min时为1.03±0.21，磷酸化JNK和0 min时(0.56±0.12)比较差异有统计学意义(P<0.05)。张应力组30 min时间点磷酸化JNK条带灰度值最高，至60 min磷酸化水平又明显减少，接近刺激前水平。压应力组刺激5 min时为0.98±0.30，JNK/MAPK蛋白磷酸化表达增多和0 min时(0.62±0.22)比较差异有统计学意义(P<0.05)。压应力组15 min时为1.47±0.52，磷酸化JNK水平表达最高，和0 min时比较差异有统计学意义(P<0.05)。压应力组30 min时磷酸化JNK水平开始下降，在压应力组60 min时磷酸化JNK水平接近机械刺激前水平，见图1。

图1 机械张应力和压应力刺激A549细胞后不同时间点磷酸化JNK、总JNK、内参β-actin的表达

3 讨 论

体外培养细胞然后施加机械应力刺激的力学模型是目前较为新颖的研究方式，已经应用于呼吸领域[12]。肺泡上皮细胞在受到机械力刺激后，胞内钙离子浓度出现变化，肌动蛋白丝聚合等，并引发了后续细胞内一系列信号转导[13]。JNK广泛存在于真核细胞中，介导机体细胞的生长、分化、分裂、死亡等多种生物学行为，是细胞信息传递的枢纽。JNK位于细胞质,相对分子质量为46×103和54×103，通过苏氨酸和酪氨酸残基羟基侧链的双重磷酸化而被激活。JNK蛋白激酶有3个基因编码：JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2基因在全身广泛表达，主要在生物学和病理过程中发挥作用。多种细胞外信号如热损伤、紫外线、渗透压改变、放射线、炎性信号因子、氧自由基、休克等均可激活JNK/MAPK信号通路[14]。研究发现机械牵拉刺激可活化JNK/MAPK信号通路，促进心肌细胞增生[15]。而关于机械牵拉刺激肺上皮细胞是否能激活其JNK MAPK信号通路目前尚未见详细研究。

本课题组应用4点加力装置，通过免疫印迹法观察机械应力刺激肺上皮A549细胞内JNK信号通路的活化情况。该4点加力装置，可以分别提供张应力和压应力。本研究观察到0 min时经机械应力伪刺激仍然有低水平的JNK磷酸化阳性反应，说明正常情况下的A549细胞有一定量的JNK磷酸化本底。通过不同类型的应力刺激，观察细胞内的信号因子的变化情况。本研究发现，不论哪种应力刺激，A549细胞受到机械应力作用后，细胞内的磷酸化JNK水平均有增高，并有一定的时间变化规律，提示JNK可能参与了A549细胞内的机械应力信号转导。研究观察到，随时间进一步推移，JNK磷酸化程度反而有所下降。推测产生上述变化的原因可能是由于刺激时间过长以后，力传导因子如离子通道或细胞骨架产生耐受，在一定不应期内对持续的应力不再起反应，使得细胞内后续生物化学反应停止，中断了机械力信号向胞内传导，而原本激活的JNK已被磷酸酯酶去磷酸化失活所致。

总之，本试验对机械力刺激肺A549细胞的JNK蛋白表达变化进行了初步研究，探讨了不同种类的应力对A549细胞内重要信号因子表达的影响，提示机械应力对A549细胞JNK蛋白的磷酸化有着重要作用。这为后续研究肺细胞机械力信号转导机制打下了基础。

[1]Guerin C,Richard JC.Current ventilatory management of patients with acute lung injury/acute respiratory distress syndrome[J].Expert Rev Respir Med,2008,2(1):119-133.

[2]Villar J.Ventilator or physician-induced lung injury? [J].Minerva Anestesiol,2005,71(6):255-258.

[3]Han B,Lodyga M,Liu M.Ventilator-induced lung injury:role of protein-protein interaction in mechanosensation[J].Proc Am Thorac Soc,2005,2(3):181-187.

[4]Plataki M,Hubmayr RD.The physical basis of ventilator-induced lung injury [J].Expert Rev Respir Med,2010,4(3):373-385.

[5]Letsiou E,Rizzo AN,Sammani S,et al.Differential and opposing effects of imatinib on LPS-and ventilator-induced lung injury [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2015,308(3):L259-269.

[6]Dekker RJ,Van Soest S,Fontijn RD,et al.Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes,most specifically lung Krüppel-like factor (KLF2)[J].Blood,2002,100(5):1689-1698.

[7]Wirtz HR,Dobbs LG.Calcium mobilization and exocytosis after one mechanical stretch of lung epithelial cells[J].Science,1990,250(4985):1266-1269.

[8]Roan E,Waters CM.What do we know about mechanical strain in lung alveoli? [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2011,301(5):L625-635.

[9]Suki B,Stamenovic D,Hubmayr R.Lung Parenchymal Mechanics[J].Compr Physiol,2011,1(3):1317-1351.

[10]胡晓波，张优仪，程德云.周期性机械牵拉诱导A549细胞p38 MAPK的表达 [J].国际呼吸杂志，2012,32(10):745-748.

[11]胡晓波，程德云，张优仪，等．机械力对培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞黏附分子-1表达的影响[J]．中华结核和呼吸杂志，2009，32(2)：99-102．

[12]WatersCM,RoanE,NavajasD.Mechanobiologyinlungepithelialcells:measurements,perturbations,andresponses[J].ComprPhysiol,2012,2(1):1-29.

[13]NayakPS,WangY,NajranaT,etal.MechanotransductionviaTRPV4regulatesinflammationanddifferentiationinfetalmousedistallungepithelialcells[J].RespirRes,2015,16(1):60.

[14]GoldsmithCS,Bell-PedersenD.DiverserolesforMAPKsignalingincircadianclocks[J].AdvGenet,2013,4:1-39.

[15]ChengWP,WangBW,LoHM,etal.MechanicalstretchinducesapoptosisregulatorTRB3inculturedcardiomyocytesandvolume-overloadedheart[J].PLoSOne,2015,10(4):e0123235.

Expression of JNK/MAPK in A549 cells induced by mechanical force*

HuXiaobo1，ZhangYouyi2，ChengDeyun3△

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstPeople′sHospitalofChengduCity,Chengdu,Sichuan610041,China；2.DepartmentofRadiology,SichuanProvincialPeople′sHospital，Chengdu，Sichuan610041,China；3.DepartmentofRespiratoryMedicine,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China)

Objective To explore whether the JNK/MAPK is involved in the mechanotransduction of the A549 cells induced by mechanical force.Methods Cells were divided into ten groups:tensile stress groups(0，5，15，30，60 min),and compressive stress groups(0，5，15，30，60 min)，3 replicate wells in each group.Cells were stimulated by tensile stress or compressive stress respectively at the magnitude of 1 000 μstrain for 5，15，30，60 min.Then the protein level of JNK and phosphorylated JNK were tested by Western blot.Results After mechanical stimulation,the protein level of phosphorylated JNK/MAPK increased.These were most obviously at the 30 min time point in both tensile stress group and the 15 min time point in compressive stress group.However,the protein level of phosphorylated JNK/MAPK returned to the original level at the 60 min time point in tensile stress group and the compressive stress group.Conclusion Mechanical force activated the expression of JNK in A549 cells.JNK pathway might be involved in signal transduction in A549 cells induced by mechanical force.

pulmonary alveoli；proteins；mechanical force;A549;JNK/MAPK;tensile stress；compressive stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.007

四川省卫生厅科学研究基金项目(100051)；成都市科技计划项目(12PPYB042SF-002)。 作者简介：胡晓波(1976-)，副主任医师，博士，主要从事呼吸系统的生物力学方面研究。△

E-mail：chengdeyun@sohu.com。

R563.8；R

A

1671-8348(2016)23-3188-02

2016-04-23

2016-06-23)