整合素连接激酶抑制剂QLT0267对TEMT过程中P38MAPK表达的影响*

林智峰，贾 林，赵 丹，马 莉，唐玉玲，杨 锐，杨晓萍△

(1.石河子大学医学院第一附属医院肾病科，新疆石河子 832008；2.石河子大学医学院，新疆石河子 832008)



整合素连接激酶抑制剂QLT0267对TEMT过程中P38MAPK表达的影响*

林智峰1，贾 林2，赵 丹1，马 莉2，唐玉玲2，杨 锐2，杨晓萍1△

(1.石河子大学医学院第一附属医院肾病科，新疆石河子 832008；2.石河子大学医学院，新疆石河子 832008)

目的 探讨在高糖诱导肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)过程中，整合素连接激酶 (ILK) 抑制剂QLT0267对P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)表达的影响。方法 体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2)，分10组，每组给予不同浓度葡萄糖及QLT0267，干预48 h。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况，计算半数抑制浓度(IC50)；随后选取对照组、高糖组、DMSO组、QLT0267(IC50)组(使用QLT0267后，HK-2细胞数量减少一半所需的QLT0267药物浓度)，免疫荧光法检测各组ILK、P-P38MAPK的表达；Western blot 检测各组ILK、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化-蛋白激酶B(P-AKT)、P-P38MAPK、P38MAPK、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，观察各组表达差异性，探讨在TEMT过程中QLT0267对P38MAPK的影响。结果 30 mmol/L的葡萄糖干预48 h HK-2细胞增殖显著，同时上调细胞中ILK、P-AKT、P-P38MAPK、α-SMA的表达；QLT0267在抑制HK-2细胞增殖的同时，可以通过下调ILK下游P-AKT的表达，阻止P38MAPK活化，进而减少HK-2细胞中α-SMA的表达，延缓TEMT进程。 结论 QLT0267可能通过部分阻止P38MAPK的活化，从而延缓HK-2细胞TEMT进程。

糖尿病肾病；近端小管上皮细胞；转分化；整合素连接激酶；P38丝裂原活化蛋白激酶；QLT0267

随着病情进展，糖尿病肾病终将发展为肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)，而RIF是终末期肾脏病的主要病理基础之一，危害性大，是近年来的研究热点。报道证实，肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation,TEMT)在RIF过程中起着重要的作用[1]。因此，探究TEMT过程的发生机制，寻找有效的作用靶点，早干预，早治疗，对延缓RIF病程进展有着十分重要的意义。

众所周知，整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族上游信号分子，在正常肾小管上皮细胞中不表达或仅少量表达， TEMT后表达增高，是信号传导的重要枢纽[2]。P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)是MAPK家族成员之一，其活化在一定程度上可以加速TEMT的进程[3]，然而，ILK是否通过P38MAPK信号途径参与TEMT的病程进展目前鲜有文献报道，因此本研究拟用不同浓度ILK抑制剂QLT0267，旨在观察QLT0267对P38MAPK表达的影响，探讨在高糖诱导TEMT过程中ILK与P38MAPK的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 人近端肾小管上皮细胞(HK-2，上海通派公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)，DMEM(无糖)/F12培养基(Gibicol公司)，0.25%胰蛋白酶+乙二胺四乙酸(EDTA，Heclon公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，Solarbio公司)，QLT0267、二甲基亚砜(DMSO，上海前尘生物科技有限公司，QLT0267溶剂)，兔抗人ILK抗体(Abcam公司)，兔抗人蛋白激酶B(AKT抗体)、兔抗人磷酸化-蛋白激酶B(P-AKT)抗体、兔抗人P38MAPK抗体、兔抗人P-P38MAPK抗体(Cell Signaling公司)，鼠抗人α-SMA抗体(Abcam公司)、多聚甲醛(博士德生物公司)、山羊血清(中杉金桥公司)。

1.1.2 主要仪器 xMark酶联免疫检测仪(BIO-RAD公司)、显微镜(Olympus公司)，LSM 510META共聚焦显微镜(Zeiss公司)，XR+凝胶成像仪(BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 购置HK-2细胞株，用含10%FBS的DMEM/F12培养液传代培养，取第 2～7 代细胞用于试验。分为10组：(1)对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)；(2)高糖组(30.0 mmol/L葡萄糖)；(3)DMSO组(30.0 mmol/L葡萄糖+与Q30组剂量相同的DMSO；(4)Q0.05组(30.0 mmol/L葡萄糖+0.05 μmol/L QLT0267)、(5)Q0.5组(30.0 mmol/L葡萄糖+0.50 μmol/L QLT0267)；(6)Q10组(30.0 mmol/L葡萄糖+10.00 μmol/L QLT0267)；(7)Q20组(30.0 mmol/L葡萄糖+20.00 μmol/L QLT0267)；(8)Q30组(30.0 mmol/L葡萄糖+30.00 μmol/L QLT0267)；(9)Q50组(30.0 mmol/L葡萄糖+50.00 μmol/L QLT0267)；(10)Q100组(30.0 mmol/L葡萄糖+100.00 μmol/L QLT0267)干预48 h。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.2.2 MTT法检测HK-2细胞增殖 收集对数期HK-2细胞，接种于96孔板内，次日同步化12 h，按上述分组加药，每组6个复孔，干预48 h；换液后每孔加入100 μL完全培养液及20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)；继续培养4 h后，吸去孔内培养液，加入150 μL DMSO，酶标仪中低速振荡3次，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔光密度(OD)值；试验重复3次，并按以下公式计算抑制率，抑制率=[OD高糖组-ODQLT0267(IC50)组]/OD高糖组×100%，SPSS法计算半数抑制浓度(IC50)[4]，选取QLT0267(IC50)组。

1.2.3 免疫荧光法检测 取对数期细胞于6孔板中爬片，细胞数约8 000/张，按对照组、高糖组、DMSO组、QLT0267(IC50)组加药干预48 h。4%多聚甲醛固定，10%山羊血清封闭30 min，滴加兔抗人单克隆ILK(1∶400)、P-AKT(1∶1 000)、P-P38MAPK(1∶800)抗体，4 ℃孵育过夜，FITC标记山羊抗兔抗体(1∶100)室温孵育1.5 h，封片，采图，AIM examiner系统进行荧光强度分析。

1.2.4 Western blot检测 取对数期细胞种板，按对照组、高糖组、DMSO组、QLT0267(IC50)组加药，干预48 h后冰上裂解并收集细胞，12 000 r/min 4 ℃离心25 min，提取蛋白，蛋白质定量试剂盒 (BCA 法)测蛋白浓度，配平后加入5×loading buffer煮沸，使蛋白变性，上样电泳，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)转膜，5%脱脂奶粉或BSA室温封闭2 h，兔抗人单克隆ILK、P-AKT、AKT、P-P38MAPK、P38MAPK 抗体(1∶1 000～1∶2 000)或鼠抗人单克隆α-SMA抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶20 000)室温孵育2 h，暗室曝光，凝胶成像和Gel-Pro analyzer分析系统进行灰度分析。

2 结 果

2.1 不同浓度QLT0267干预48h对HK-2细胞增殖的影响 与对照组相比，高糖组、DMSO组、Q0.05组、Q0.5组HK-2细胞OD值增高(P<0.05)，Q10、Q20、Q30、Q50、Q100组HK-2细胞OD值降低(P<0.05)。与高糖组相比，DMSO组及浓度低于0.5μmol/L的QLT0267对细胞无显著抑制作用(P>0.05)，Q10、Q20、Q30、Q50、Q100组细胞数目明显减少(P<0.05)，细胞增殖抑制率分别为23.8%、48.7%、65.0%、75.1%、84.9%(表1)。根据上述细胞增殖抑制率的情况，通过SPSS计算QLT0267 的IC50浓度(用QLT0267后活细胞数量增殖抑制率为50%的浓度)，约为24.5～32.1μmol/L，故依据前期试验结果选取28μmol/L为QLT0267的IC50浓度，即为QLT0267(IC50)组。

表1 干预48 h后各组HK-2细胞OD值

图1 激光共聚焦法、Western blot检测HK-2细胞中ILK的表达(×200)

2.2QLT0267作用48h对HK-2细胞中ILK表达的影响 激光共聚焦法、Westernblot检测各组中ILK表达情况显示，对照组中ILK蛋白表达量较低，与对照组相比，高糖组、DMSO组、QLT0267(IC50)组ILK荧光强度显著增高(F=12.382，P<0.05)，但3组间荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。Western印迹法结果与免疫荧光法结果一致(F=1 090.078， P<0.05)，见图1、2。

2.3QLT0267干预48h对HK-2细胞中AKT、P-AKT表达的影响 对照组中P-AKT灰度值较低，且其蛋白表达量低于其余3组(F=16 979.843，P<0.05)；高糖组与DMSO组组间P-AKT灰度值差异无统计学意义(P>0.05)；与高糖组相比，QLT0267(IC50)组灰度值降低，差异有统计学意义(P<0.05)。两种方法检测细胞蛋白水平差异无统计学意义(F=105.62，P<0.05)。各组间AKT灰度值差异无统计学意义(F=1.103，P>0.05)，见图3、4。

图2 Western blot检测QLT0267干预48 h对HK-2细胞中ILK表达的影响

图3 免疫荧光检测HK-2细胞中P-AKT的表达(×200)

2.4QLT0267干预48h对HK-2细胞中P38MAPK、P-P38MAPK表达的影响 对照组中P-P38MAPK灰度值最低。与对照组相比，高糖组、DMSO组、QLT0267(IC50)组P-P38MAPK灰度值显著增高(F=1 027.973，P<0.05)；与高糖组相比，DMSO组中P-P38MAPK蛋白差异无统计学意义(P>0.05)，QLT0267(IC50)组中P-P38MAPK蛋白表达量下调(P<0.05)。各组间P38MAPK灰度值不随药物干预而变化(F=1.125，P>0.05)。免疫荧光法检测细胞中P-P38MAPK表达，结果较前基本一致(F=40.885，P<0.05)，见图5、6。

2.5QLT0267干预48h对HK-2细胞中α-SMA表达的影响 对照组中α-SMA仅少量表达，与对照组相比，其余3组α-SMA表达均增高(F=1 051.225，P<0.05)。与高糖组相比，DMSO组不能显著下调TEMT后HK-2细胞中α-SMA的表达(P>0.05)，QLT0267(IC50)组可以使α-SMA蛋白表达量显著降低(P<0.05)，见图7。

图4 Western blot法检测各组HK-2细胞中AKT、P-AKT表达

图5 免疫荧光检测HK-2细胞中P-P38MAPK的表达(×200)

图6 Western blot检测HK-2细胞中P38MAPK、P-P38MAPK的表达

图7 Western blot 检测HK-2细胞中α-SMA的表达

3 讨 论

正常肾间质中，细胞外基质(ECM)的生成与降解始终处于动态平衡状态，病理情况下，平衡遭到破获，导致过量的ECM在肾间质内蓄积，最终引起RIF。研究表明TEMT与RIF关系密切，其严重程度与预后密切相关[4]，而表达α-SMA的肌成纤维细胞的出现是TEMT开始的标志[5]。本试验证实，30mmol/L葡萄糖作用48h，可促进HK-2细胞增殖，同时α-SMA表达增高，佐证转分化模型成功。在此过程中ILK、P-P38MAPK表达均增高，而ILK作为MAPK家族上游蛋白，是否能够通过活化的MAPK家族成员P38MAPK参与TEMT过程值得讨论。

ILK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞-细胞外基质连接处的重要分子骨架， 对ECM具有调控作用[6]，其特异性抑制剂QLT0267可以通过抑制ILK下游AKT磷酸化进而发挥其抑制效果[7]。研究发现，在抑制肿瘤细胞生长、降低糖尿病大鼠尿清蛋白/肌酐比值等过程中，QLT0267可通过上述途径发挥治疗作用[8-16]。同时，周娲等[10]也发现，多条信号通路参与了TEMT过程，TGF-β/ILK是其中之一，在该过程中ILK表达增高，与本试验结果一致。此外，本研究发现，QLT0267可以抑制ILK下游AKT活化进而使α-SMA表达降低，延缓TEMT进展。

p38MAPK表达于所有类型的细胞中，在控制细胞增殖、分化、转化及凋亡等生理过程中起主要作用[11-12]。P38MAPK被磷酸化为P-P38MAPK而激活，进而完成调节相关基因转录[13]。在TEMT过程中，P38MAPK通过保守的三级激酶级联形式激活，抑制P38MAPK的磷酸化，改善糖尿病肾病中肾脏的炎性病变，延缓TEMT的进程[14]。

目前已有报道纳米材料可以激活ILK/p38MAPK通路，引起成骨细胞分化，证实P38MAPK是ILK下游的效应分子[15]；同时，Smeeton等[16]也发现ILK可通过P38MAPK信号通路阻碍发育过程中输尿管胚芽的生长。本研究通过免疫荧光法、Westernblot法证实，在TMET过程中，QLT0267可以通过下调P-AKT的表达，显著抑制P38MAPK活化，而不改变P38MAPK总蛋白表达量，但其P-P38MAPK表达量仍高于对照组，提示多条信号途径参与TEMT过程；ILK可能可以通过活化P38MAPK以外的其他信号途径参与TEMT过程；QLT0267尚不能完全抑制ILK下游蛋白活化；ILK阻断P38MAPK活化可能具有平台效应。与此同时，α-SMA表达亦减少，提示TEMT得到改善。

综上所述，QLT0267可以通过特异性阻止ILK下游蛋白AKT的活化，有可能抑制部分的细胞增殖，下调高糖诱导TEMT过程中P-P38MAPK的表达，延缓DN过程中TEMT的进程。

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The effect of QLT0267 which is inhibitor of ILK on P38MAPK in process of HK-2 cells TEMT*

LinZhifeng1,JiaLin2,ZhaoDan1,MaLi2,TangYuling2,YangRui2,YangXiaoping1△

(1.DivisionofNephrology,theFirstAffiliatedHospital,CollegeofMedicine,ShiheziUniversity，Shihezi,theXinjiangUygurAutonomousRegion832008,China；2.MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,theXinjiangUygurAutonomousRegion832008,China)

Objective To observe the effect of different concentrations of QLT0267 which is the inhibitor of integrin-linked kinase(ILK) on P38 mitogen activated protein kinase (P38MAPK),in process of high glucose-induced tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation (TEMT).Methods The cultured human renal tubular epithelial(HK-2) cell were divided into 10 groups by the different concentrations of GS and QLT0267,cultured 48 h.The inhibition ratio in each group was calculated by the method of MTT,and found concentration which inhibit rate was 50%(IC50).Then we selected control group,high-glucose group,DMSO group and QLT0267(IC50)group(The concentration of QLT0267,which led to the HK-2 cell reduced by half).The protein of ILK,AKT,P-AKT,P38MAPK,P-P38MAPK and α-smooth muscle actin (α-SMA) were detected by the method of immunofluorescence and Western blot.We observed the differences in each group and explored the relationship between ILK and P38MAPK in the process of TEMT.Results HK-2 cell proliferated significantly after 30 mmol/L glucose intervention for 48 h，and at the same time it upregulated the expression of ILK,P-AKT,P-P38MAPK,α-SMA.50% HK-2 cell inhibited at the concentration of 28 μmol/L QLT0267.It decreased both the expression of P-AKT which down-regulated the expression of ILK,and the expression of P-P38MAPK,thereby reducing the expression of α-SMA and delaying process of TEMT at the concentrations of 28 μmol/L QLT0267 in HK-2 cell.Conclusion 28 μmol/L QLT0267 might inhibit HK-2 cell TEMT by decreasing the expression of P38MAPK.

diabetic nephropathy;kidney tubules epithelial cells;epithelial-mesenchymaltransition;ILK;P-38MAPK;QLT0267

石河子大学科学技术研究发展计划基金资助项目(2013ZRKXYQ-YD16)。 作者简介：林智峰(1981-)，主治医师，硕士，主要从事肾小管疾病研究。△

论著·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.013

R692

A

1671-8348(2016)23-3206-04

2016-04-24

2016-07-24)