复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠血清ADMA水平及胸主动脉eNOS、NF-κB表达的影响

边 云 田风胜 张 倩 石 骁 刘瑞雪



复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠血清ADMA水平及胸主动脉eNOS、NF-κB表达的影响

边 云 田风胜*张 倩 石 骁 刘瑞雪

目的：观察复荣通脉胶囊对糖尿病(DM)大鼠血清非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、核转录因子-κB(NF-κB)表达水平的影响，进一步探讨其防治DM大血管病变的作用机制。方法：60只Wistar大鼠先分为空白对照组(n=10)和造模组(n=50)，后者复制DM模型后，再分为DM组(n=9)、复荣通脉低剂量组(n=10)、复荣通脉中剂量组(n=9)和复荣通脉高剂量组(n=9)，低、中、高剂量组分别给予0.7、1.4、2.8g/kg体重复荣通脉胶囊灌胃，其余两组给予等量纯净水灌胃。8周后，从胸主动脉采血检测ADMA水平；留取胸主动脉制备病理切片，SP法免疫组化染色观察胸主动脉eNOS和NF-κB阳性染色面积及强度。结果：与空白对照组比较，DM组及复荣通脉低、中、高剂量组血清ADMA水平及组织NF-κB表达明显增加(P<0.01),组织eNOS表达明显降低(P<0.01)；与DM组比较，复荣通脉低、中、高剂量组血清ADMA水平及组织NF-κB表达明显降低(P<0.01)，组织eNOS表达明显升高(P<0.01)；中、高剂量组ADMA、NF-κB的降低和eNOS的升高更明显(P<0.05)。结论：复荣通脉胶囊通过降低DM大鼠血清ADMA水平，上调胸主动脉eNOS和下调NF-κB的表达，对大血管病变发挥保护作用。

复荣通脉胶囊；糖尿病大鼠；非对称性二甲基精氨酸；内皮型一氧化氮合酶；核转录因子-κB

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是由胰岛素分泌不足或功能缺陷引起的，以慢性高血糖为主、合并脂肪和蛋白质代谢紊乱为特征的临床综合征。DM血管病变作为DM慢性并发症之一，是DM致残致死的最主要原因。DM大血管病变的病理基础为动脉粥样硬化(Arteriosclerosis，AS)，而内皮细胞受损和内皮依赖性血管舒张功能障碍启动AS，并贯穿于AS发生发展的整个过程中。复荣通脉胶囊是与本院自制中药制成的复方制剂(冀药制字Z20070041)，具有益气养阴、活血通络功效，开发之初主要用于治疗DM性周围血管病变及周围神经病变，之后发现其对DM大血管病变亦疗效显著，且能预防血栓形成。但其作用机制不甚明了。本研究通过DM大鼠模型观察复荣通脉胶囊对其血清非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平和胸主动脉内皮型一氧化合酶(eNOS)和核转录因子-κB(NF-κB)表达的影响，探讨其保护内皮细胞和内皮依赖性血管舒张功能，从而防治大血管病变的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级健康雄性Wistar大鼠(体重 200g±30g)60 只，由河北医科大学实验动物中心提供[动物合格证号：1405034，单位许可证号：SCXK(冀)2013-1-003]。分笼(每笼4只)饲养，自由饮水，室温22℃-26℃。湿度45%-65%，每日12h光照维持，昼夜循环。

1.1.2 实验药物：复荣通脉胶囊，主要由水蛭、地龙、全蝎、黄芪、当归、玄参、葛根、穿山龙、首乌藤、川牛膝、甘草等组成，由河北省沧州中西医结合医院中药制剂室监制生产，每粒0.5g，批准文号：冀药制字Z20070041，生产批号：140310。实验时按比例加入纯净水制成混悬液。

1.1.3 实验试剂和仪器：链脲佐菌素(STZ)、柠檬酸钠为美国sigma公司产品；ADMA ELISA试剂盒，eNOS、NF-κB免疫组化试剂盒由石家庄市淼森科技有限公司提供；德国罗氏公司血糖仪(罗康全活力型)；日本日立公司7600-010型全自动生化分析仪；日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11光学显微镜及其照相装置；病理组织漂烘处理仪；病理图文分析系统；日本HM-200电子天平和德国Eppendorf-5430离心机；德国莱卡RM2015石蜡切片机；日本三洋MDF-382E型超低温冰箱和江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型恒温水浴箱；美国Media Cybernetics 公司多功能真彩色细胞图像分析管理系统。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及复制DM模型：60只实验Wistar大鼠，适应性喂养1周后，按照完全随机原则分为空白对照组(n=10)和DM造模组(n=50)，造模组大鼠禁食12h后按文献[1，2]方法(略作改进)，一次性腹腔注射1% STZ 60mg/kg(临用前将STZ粉溶于0.1mmol/L、pH4.2无菌柠檬酸钠缓冲液)；空白对照组腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。72h后尾静脉取血测血糖(BG)，BG≥16.7mmol/L确定为DM模型大鼠。本次造模有3只大鼠BG未达诊断标准，并死亡3只，共造模成功44只。平稳一周后进行下述实验。

1.2.2 药物干预：44只成模大鼠按照数据表法抽取40只平分DM组、复荣通脉低剂量组、复荣通脉中剂量组和复荣通脉高剂量组，每组10只。另4只用作其它实验。参考文献方法，按人体-大鼠体表面积比值表换算出实验大鼠等效剂量[1]，每天新鲜配制药液(准确称取实验所需药粉溶于纯净水中)。复荣通脉中剂量组给予1.4g/kg体重灌胃、复荣通脉低剂量组给予0.7g/kg体重灌胃、复荣通脉高剂量组给予2.8g/kg体重灌胃，容积10ml/kg，每日一次，连续8周。空白对照组和DM组每日给予等量纯净水灌胃。期间大鼠自由进食标准饲料，自由饮水，每天更换垫料，清理实验室。

1.2.3 BG和血清ADMA水平测定：连续灌胃8周后，各组大鼠隔夜禁食12h(饮水不限)，空腹称重，以3%戊巴比妥钠(80mg/kg)[2]腹腔注射麻醉，尾尖采血，用罗氏血糖仪检测BG水平；之后，迅速常规方法开胸、分离胸主动脉，从胸主动脉采血2ml，按试剂盒说明书采用ELLSA检测血清ADMA水平。

1.2.4 组织eNOS、NF-κB水平测定：分离各组大鼠胸主动脉1-2cm，置于4%多聚甲醛中固定，洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(5μm)，采用免疫组化SP法染色，严格按照试剂盒说明书操作。应用彩色病理图文分析系统计算病理组织切片中eNOS、NF-κB阳性染色面积与视窗面积的百分比(%)。细胞核和(或)细胞质出现棕黄色、棕褐色颗粒为阳性组织。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠存活情况及BG水平

复荣通脉治疗8周后，DM组死亡1只(可能为腹部注射STZ继发感染所致)；复荣通脉中剂量组死亡1只，可能死于酮症酸中毒或高渗综合征；复荣通脉高剂量组逃逸1只。治疗前，DM组及复荣通脉低、中、高剂量组BG水平明显高于空白对照组(P<0.01)，且四组间无明显差异(P>0.05)。治疗8周后，DM组和复荣通脉低、中、高剂量组BG水平虽较治疗前降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。DM组及复荣通脉低、中、高剂量组BG水平仍然明显高于空白对照组(P<0.01)，但四组间仍无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后BG比较±s)

注：与空白对照组比较，1)P<0.01

2.2 各组血清ADMA水平比较

治疗8周后，与空白对照组比较，DM组血清ADMA水平明显升高(P<0.05)；与DM组比较，复荣通脉低、中、高剂量组血清ADMA降低，复荣通脉中、高剂量组血清 ADMA水平降低更明显(P<0.05)，且中、高剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。 见表2 。

表2 各组大鼠治疗8周后血清ADMA水平比较±s)

注：与空白对照组比较，1)P<0.05;与DM组比较，2)P<0.05；与复荣通脉低剂量组比较,3)P<0.05

2.3 各组胸主动脉eNOS表达水平比较

免疫组化染色结果显示，胸主动脉内皮SP染色eNOS阳性细胞胞膜呈棕、黄色。空白对照组eNOS阳性染色面积较大，DM组显著减少(P<0.01)，复荣通脉低、中、高剂量灌胃治疗8周后胸主动脉eNOS阳性面积较DM组增加(P<0.01)；尤其中、高剂量治疗组阳性面积更大于低剂量组(P<0.05)；且中、高剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)，但仍小于空白对照组(P<0.05)。见图1、表3。

2.4 各组胸主动脉NF-κB表达水平比较

免疫组化染色结果显示，胸主动脉内膜SP染色NF-κB阳性细胞核呈棕、褐色。空白对照组NF-κB阳性面积较小，DM组面积较大(P<0.01)，复荣通脉低、中、高剂量灌胃治疗8周后大鼠胸主动脉NF-κB阳性面积明显较DM组明显减少(P<0.01)，其中、高剂量组更少于低剂量组(P<0.05)；且中、高剂量组间无明显差异(P>0.05)；但仍多于空白对照组(P<0.05)。见图2、表3。

[本文图1、图2见封2]

3 讨 论

有研究在4 845例DM患者中发现大血管病变率达38.3%[3]。AS是DM血管病变的病理基础，贯穿血管病变始终。高血糖可加速AS进程，导致全身多处大血管受累，发生弥漫性管腔狭窄及多发不稳定斑块，引起多种DM性心脑血管疾病，如冠心病、脑卒中及肾动脉硬化、下肢动脉硬化、坏疽等，是造成DM患者致残和死亡的主要原因[4]。

表3 各组大鼠胸主动脉eNOS、NF-κB表达水平比较

注：与空白对照组比较，1)P<0.01; 与DM组比较,2)P<0.01;与复荣通脉低剂量组比较,3)P<0.05

NO作为人体内的血管舒张因子，不仅能够舒张血管、促进内皮细胞生长，还能抑制白细胞趋化、黏附和血小板聚集，同时抑制平滑肌细胞增殖[5]，具有抗AS作用。高血糖诱导氧化应激触发的线粒体呼吸链传递效应以及血管内皮细胞来原ADMA均可使体内反应性氧产物(Reactive Oxygen Species,ROS)增多[6,7]，引起eNOS表达下调及NO的生物利用度降低，进而导致内皮功能障碍[8，9]。ADMA是L-精氨酸类似物，具有竞争性抑制eNOS活性部位和降低eNOS活性、调节NO合成的作用[10]。而且，体内ADMA水平升高导致NOS失偶联产生的过多自由基又会使ADMA进一步升高，从而损伤血管内皮，造成血管病变[11]。NF-κB是细胞内普遍存在的二聚体核转录因子，主要参与包括免疫和炎性细胞的基因转录，调节多种参与及加速AS基因的表达，包括细胞因子、细胞间黏附分子(ICAM-1)、血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1)、NOS、血管紧张素II(AngII)等，在DM血管病变中发挥作用。徐雪晶等[12，13]的实验发现，ADMA也可能通过以下NF-κB途径介导AS：(1)增强氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)表达，促使巨噬细胞转化为泡沫细胞；(2)升高iNOS的表达水平，促进巨噬细胞转化为泡沫细胞。从而不断加速DM血管病变的发生发展。

本研究中，DM大鼠胸主动脉ADMA水平及NF-κB表达明显升高，eNOS表达明显降低，表明ADMA、NF-κB、eNOS在DM大血管并发症中起重要作用。不同剂量复荣通脉胶囊均可降低血清ADMA水平，同时抑制NF-κB、促进eNOS在大鼠胸主动脉的表达，尤以中、高剂量组效果更好，且中、高剂量组间无差异。提示复荣通脉胶囊可改善血管内皮功能紊乱，对DM大血管病变具有一定治疗作用，推荐临床使用以中剂量为宜。

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本文第一作者简介：

边 云(1987-)，女，汉族，硕士，住院医师，主要从事糖尿病的中西医结合临床研究

1 徐淑云,卞如濂, 陈 修. 药理实验方法[M].北京：人民卫生出版社, 2005：202-204.

2 徐淑云,卞如濂,陈 修,药理实验方法[M].北京：人民卫生出版社, 2005:1 846-1 849.

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13 徐雪晶, 何 军, 张新金, 等. NF-κB介导ADMA上调大鼠腹腔巨噬细胞LOX-1的表达[J]. 华中科技大学学报(医学版), 2010, 39(6):771-774.

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Influence of Furongtongmai Capsule on the Expression of eNOS and ADMA, NF-κB in Thoracic Aorta Tissue of Diabetic Rats

BIAN Yun, TIAN Feng-sheng*,ZHANG Qian,SHI Xiao,LIU Rui-xue

Department of Endocrinology,Affiliated CangZhou Traditional-western Combination Medical Hospital of Hebei Medical University, Cangzhou 061001，China;*Corresponding author

Objective: To observe the effect of traditional chinese medicine compound preparations -Furongtongmai capsule on the expression of eNOS, ADMA and NF-κB on thoracic aorta tissue of diabetic rats, and the protective effects of Furongtongmai capsule on the diabetes vascular lesions were examined in this study. Method: 60 Wistar rats were randomly divided into two groups: normal control group (NC,n=10), build modle group (n=50). After diabetes mellitus(DM) rats were made,40 of diabetes rats were randomly divided into DM group(n=9), Fu rong tong mai capsules low dosage group(FRL)(n=10), Fu rong tong mai capsules middle dosage group(FRM)(n=9), Fu rong tong mai capsules high dosage group(FRH)(n=9). FRM was given the 1.4 g/(kg body weight) to fill the stomach,FRL was given 0.7 g/kg body weight, FRH was given 2.8 g/(kg body weight) , the rest of the two groups of daily to give the same dose of purified water. 8 weeks later, 2 mL blood was taken from thoracic aortic for serum ADMA betection. The expression of eNOS and NF-κB on thoracic aortic tissue were examined with immunohistochemical staining.The positive area and integrated optical density (IOD) was measured by colour image analytic system. Results: Compared with NC group,DM group and FRL,FRM,FRH groups retinal capillary expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.01)，the expression of eNOS decreased(P<0.01). Compared with DM group, FRL,FRM,FRH groups retinal capillary expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.01)，the expression of eNOS increased(P<0.01). Compared with FRL group, FRM and FRH group expression of ADMA and NF-κB significantly increased (P<0.05)， eNOS increased(P<0.05).Conclusion: Furongtongmai capsule can reduce serum ADMA level. Beside it can inhibit the NF-κB and promote the expression of eNOS in thoracic aorta in rats.Furongtongmai capsule plays a protective role on blood vessels. So it has a certain therapeutic effect on diabetic vascular lesions.

Furongtongmai capsule; Diabetic rats; ADMA; eNOS; NF-κB

河北省沧州中西医结合医院内分泌三科，沧州 061001；*

本文2016-08-20收到，2016-09-31修回

R587.1；R285.5

A

1005-1740(2016)04-0011-04