新发现Leber先天性黑矇患者复合杂合突变位点c.1831T>C/c.2172T>A

徐献群 王 陈 吴业勤 黄朱亮 严 明



新发现Leber先天性黑矇患者复合杂合突变位点c.1831T>C/c.2172T>A

徐献群1王 陈1吴业勤1黄朱亮1严 明2，*

目的：报告一例散发Leber先天性黑矇(LCA)家系的致病基因复合杂合突变位点c.1831T>C/c.2172T>A。方法：收集LCA患儿临床和家系资料，采集该家系成员患儿及其父母外周静脉血，提取基因组DNA，先行目标区域捕获测序筛查已知的眼科遗传病相关基因，再利用生物信息学分析获取候选基因，最后经Sanger法测序验证及对突变位点进行分子生物信息学分析。结果：高通量测序筛查结果证实患儿CRBI基因上存在复合杂合突变(c.1831T>C，p.S611P；c.2172T>A，p.Y724X)。c.2172T>A为无义突变，具有明显的致病性。Anthe_2000软件分析p.S611P突变未引起蛋白二级结构和疏水性明显变化。结论：CRBI基因的复合杂合突变(c.1831T>C,c.2172T>A)可能导致LCA8型的发生。

Leber先天性黑矇；CRBI基因复合杂合突变

Leber先天性黑矇(Leber Congenital Amaurosis, LCA)由德国眼科医生Theodor Leber 于1869年首先报道[1]，是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变，也是1岁以内婴幼儿致盲的主要原因，占遗传性视网膜疾病的5%以上，占盲校儿童致盲原因的20%[2]。其临床特征为固视障碍、畏光、眼球震颤、指压眼球。早期眼底多正常，晚期可出现脉络膜萎缩、视网膜血管狭窄、骨细胞样色素和椒盐样色素沉着等。

LCA具有高度异质性及表型多样性，多呈常染色体隐性遗传。分子生物学研究业已证实LCA的发生涉及不同功能通路的至少22个基因，这些基因的突变占所有LCA病因的75%左右[3]。而更广泛、深入的探讨研究，包括找寻新的突变位点的工作仍在不断进行之中。本文作者采用目标区域捕获测序技术对一例散发LCA家系进行致病基因筛查过程中发现先证者存在复合杂合突变位点c.1831T>C/c.2172T>A，且在此之前未见报道，遂于首次报道。

1 资料与方法

1.1 临床病例

患儿，女，1岁，门诊时发现患有斜视、畏光，视力不正常、怕暗，色盲本可部分识别，喜用手指触压眼球，不能固视和追视，疑诊为LCA。光学相干断层扫描示整个视网膜变薄。采用眼部广域数字成像系统(RetCamⅢ)眼底检查示双眼黄斑区地图样萎缩灶，视网膜血管普遍变细、扭曲，视网膜从后极到周边部呈现广泛的椒盐样色素沉着(图1)。视网膜电图表现为a、b波平坦，甚至消失。

1.2 家系分析

患儿父母非近亲结婚，无LCA临床表现，家系图谱见图2。

注：□为正常男性，○为正常女性，●为女性患者；

1.3 遗传分子学检测方法

采集该家系LCA先证者及其父母肘静脉血，采用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)按照常规操作提取DNA备检。

1.3.1 目标区域捕获测序：将先证者基因组DNA用Covaris S2(美国Massachusetts公司)打断，制备200-300bp的基因组双末端文库；用定制化捕获芯片(美国Agilent SureSelect公司)捕获眼科遗传病相关基因的外显子及相邻内含子区域(50bp)；然后将文库在芯片上富集和杂交72h[4]；杂交完成后，将芯片按标准流程洗脱；最后将捕获到的文库通过Illumina HiSeq2000 Analyzers(美国Illumina公司)进行测序。按照产品标准测序流程，每个read 90个循环产生双末端reads。碱基识别和图像分析由Illumina Pipeline(美国Illumina公司)执行并产生原始数据。测序数据运用NextGene V2.3.4软件(美国SoftGenetics公司)与UCSC数据库(美国California Santa Cruz大学)提供的人类基因组(hg19)参考序列进行比对。

1.3.2 生物信息学分析：所有的单核苷酸变异、插入和缺失都经过NCBI SNP数据库、人类基因组单体型图计划数据库、1000人基因组计划数据库筛选。对以上测序发现的可疑致病性突变与人类基因突变数据库(HGMD)比对，判断是否为已知突变。同时运用错义在线预测软件PolyPhen-2和Mutation Taster分析突变对蛋白质功能的影响。并采用同源序列多重比对，分析突变位点在不同物种间的保守性。再利用Anthe_2000软件(法国Biology and Chemistry of Proteins研究院)进行蛋白二级结构和疏水性分析。

1.3.3 Sanger法测序验证：将经过测序和信息学分析筛选的候选突变基因采用PCR和Sanger测序验证。PCR引物用Primer 5.0软件设计，扩增产物用Bigdye terminator循环测序试剂盒(ABI, Foster City, CA, USA)测序，采用ABI 3130型遗传分析仪(美国应用生物系统公司)进行分析。同时将候选基因突变在先证者父母中验证，判断突变的来源。

2 结 果

2.1 目标区域捕获测序

对已知的365个眼科遗传病相关基因的目标区域捕获测序，并采用多个数据库进行综合分析。经过与hg19比对，共发现变异3 578个，过滤掉不影响氨基酸改变的位点后剩下311个，再过滤掉频率>0.01的位点后，只剩下4个变异：ASB10[5]杂合的插入突变(c.1238_1239insA)、POMT1[6]的杂合错义突变(c.1303A>G)和CRBI的复合杂合错义突变(c.1831T>C, p.S611P；c.2172T>A, p.Y724X)。前两个基因的变异为隐形遗传病杂合突变，与受检者临床表型无明确关联，勿需继续验证分析。而CRBI的复合杂合无义突变(c.1831T>C, c.2172T>A)是否为致病突变基因，需进一步论证。

2.2 分子生物信息学分析

c.2172T>A无义突变已被证实具有明显致病性[7]。p.S611位点在不同物种中高度保守(表1)，c.1831T>C错义突变可能对蛋白结构影响较大；p.S611P PolyPhen2预测突变分值为0.925(分值越接近1，突变造成损害的可能性越大)，很可能对蛋白质功能造成损害；Mutation Taster也显示该位点为致病突变。Anthe_2000软件分析显示p.S611P位点对蛋白二级结构和疏水性未发现明显影响。

2.3 Sanger法测序验证

Sanger测序发现，先证者母亲(Ⅰ2)携带CRBI基因c.1831T>C(p.S611P)杂合突变，先证者父亲(Ⅰ1)携带c.2172T>A(p.Y724X)杂合突变(图3)。参考有关文献[8]，先证者(Ⅱ2)存在CRBI的复合杂合错义突变(c.1831T>C, c.2172T>A)即可诊断为LCA8型。

表1 不同物种c.1831T>C突变位点同源序列比对

[本文图1、图3见封3]

3 讨 论

LCA是一种严重的先天性致盲性视网膜营养不良疾病。已知一些综合征和非综合征视网膜疾病致病基因(ALMS1、BBS4、CNGA3、IQCB1、KCNJ13和MYO7A)突变与LCA或LCA样表型相关[9-14]，而另一方面，至少有7种LCA致病基因与青少年视网膜色素变性有关[9, 15]。这种现象表明许多视网膜疾病可能具有相似的致病机制，但相同的视网膜疾病有不同的致病基因。LCA的致病基因还与其它视网膜营养不良的临床特征相关，例如锥杆细胞营养不良(CRX[16]和AIPL1[17])以及Joubert和Meckel综合征(CEP290[18, 19])。因此，LCA具有高度异质性和表型多样性，仅凭临床表型进行诊断和准确分型十分困难，精确的分子诊断对LCA极为重要。

LCA呈常染色体隐性遗传，也有少数为常染色体显性遗传，目前已知至少有22个基因的突变会引起LCA。2014年Wang等[3]对中国145个LCA家系进行了突变谱分析，发现有107个家系为纯合突变或者复合杂合突变，其中CRBI基因突变频率最高。CRBI基因定位于染色体1q31.3，仅在视网膜和脑组织中表达，编码一种和果蝇屑蛋白相似的蛋白，该蛋白定位在哺乳动物感光细胞内部，是控制眼睛极性发育的分子支架的成分。CRBI基因突变没有明显的突变热点区域，分散在整个基因中，该基因突变使感光细胞异常，导致视网膜营养不良，引起LCA。本文在先证者中发现的CRBI基因c.1831T>C(p.S611P)和c.2172T>A(p.Y724X)杂合突变，均为HGMD数据库报道的已知致病性突变，但在一个LCA患者发现c.1831T>C和c.2172T>A复合杂合突变是第一次。母亲携带CRBI基因c.1831T>C(p.S611P)杂合突变，父亲携带c.2172T>A(p.Y724X)杂合突变。此遗传方式符合常染色体隐性遗传疾病的遗传特点。PolyPhen2和Mutation Taster预测均表明c.1831T>C为致病突变，同源序列多重比对分析显示该突变位点在不同物种间高度保守，可能对蛋白结构影响较大。然而运用Anthe_2000软件对p.S611P位点进行蛋白二级结构和疏水性分析发现没有明显的变化，表明该位点的突变不影响蛋白质的二级结构和疏水性，可能对蛋白质的三级结构有影响，有待后续研究论证。

传统的Sanger法测序是对每个外显子进行直接测序，具有简便、准确、读长高等优点。但是LCA致病基因众多，外显子数量庞大，这使得直接测序成本高，工作量大。第二代测序技术不需要进行DNA模板克隆，而是使用接头进行高通量的并行PCR和并行测序反应，使测序的通量持续增长，大大促进了基因组分析技术的发展。其中全外显子测序技术更是寻找孟德尔遗传病致病基因的一种有效方法[20]。虽然外显子序列仅占人类全基因组序列的1%，但85%与人类疾病相关的基因突变都位于这些编码序列和剪切位点。因此，相比于更加繁琐的全基因组测序，这一方法能极大地提高发现致病基因的效率[20]。本研究采用的目标区域捕获测序技术，与Sanger测序相比，具有高效、准确、价廉的优势，能对LCA这类致病基因高度异质性的眼科遗传病进行快速、有效、精确的基因诊断[21-25]。但该技术中目标基因只针对已知的与疾病相关的基因，一些尚未明确的基因不在检测范围内，这也是该方法的局限所在。为保证数据分析的精确性，本方法的平均测序深度为122.54×,目标区域内覆盖度过低的变异将被滤掉。该方法可以发现小片段缺失/插入变异，但更大的缺失/重复难以准确检测；另外基因调控区及深度内含子区可能存在的致病性变异无法检测。

目前，LCA尚无根治方法。眼睛作为一个相对独立的中枢神经系统的附属器官，同时视网膜下腔具有免疫赦免的特点，为基因治疗提供比较安全的空间。2008年，Maguire等[26]在LCA患者视网膜下腔注射包含RPE65互补DNA(cDNA)的重组病毒伴随病毒(AAV)载体，使RPE65互补DNA(cDNA)在人视网膜RPE65基因启动子控制下得到表达，产生感光色素，从而取代丧失功能的色素，使患者的视力得到了不同程度的提高。近期有研究表明，患者的视网膜变性在持续进展，这种基因治疗后视力的提高有可能只是短期的[27]，其远期疗效还需要大量的临床试验去评估[28]。

综上所述，目标区域捕获测序技术为临床表现多样、致病基因众多的LCA基因变异的检测提供了新的技术手段。本研究在我国一例散发LCA患者中发现了CRBI基因的复合杂合突变(c.1831T>C, c.2172T>A)，这种复合杂合突变的组合此前未见报道。这为研究CRBI基因对人类眼部发育的作用以及LCA的发病机制提供了新的线索，也对LCA的产前诊断、遗传咨询以及基因治疗有一定的意义。

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本文第一作者简介：

徐献群(1970-)，女，汉族，硕士，主管技师，主要从事遗传病的基因诊断

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Two Compound Heterozygous Variants(c. 1831T>C/c. 2172T>A) in Leber Congenital Amaurosis

XU Xian-qun1， WANG Chen1， WU Ye-qin1， HUANG Zhu-liang1， YAN Ming2，*

1Department of Clinical Gene Diagnosis Center;2Department of Ophthaimology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China；*Corresponding author

Objective: To report two compound heterozygous variants(c.1831T>C/c.2172T>A) in a sporadic family with Leber congenital amaurosis (LCA).Method: The clinical information and family data of a LAC patient was collected. Genomic DNA was extracted from the blood samples of all family members. We developed a panel for targeted exome sequencing of the patient by selecting related genes of inherited retinal disease. Further bioinformatics analyses and Sanger sequencing were done to confirm the candidate variants. In silico analyses, including PolyPhen-2, Mutation Taster, multiple sequence alignment and protein molecular secondary structures and hydrophobicity were performed to predict the consequences of each variant identified. Results: After targeted exome sequencing and comprehensive analysis, two compound heterozygous variants (c.1831T>C, p.S611P;c.2172T>A, p.Y724X) were identified in the CRBI gene which was responsible for causing LCA. The later was a nonsense mutation that was disease-causing obviously. Protein molecular secondary structures and hydrophobicity analysis by Anthe_2000 p.S611P didn't show significant change.Conclusion: In this study, two compound heterozygous variants (c.1831T>C/c.2172T>A) in CRBI that are likely to be the disease-causing variants of LCA 8.

Leber congenital amaurosis (LCA)； CRBI gene compound heterozygous variants

武汉大学中南医院，武汉 430071；1临床基因诊断中心；2眼科；*

本文2016-07-18收到，2016-09-29修回

Q319+.31

A

1005-1740(2016)04-0015-05