海南省2个冬青叶马尾藻种群的多样性及分子系统学研究

邹潇潇，刘鑫鑫，朱 军，林 勇，黄惠琴，鲍时翔

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101）

海南省2个冬青叶马尾藻种群的多样性及分子系统学研究

邹潇潇，刘鑫鑫，朱 军，林 勇，黄惠琴，鲍时翔

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101）

为了解海南省冬青叶马尾藻不同地理种群的多样性，从潭门镇和长坡镇收集到12份冬青叶马尾藻样品，通过PCR扩增和测序获得了其cox1（细胞色素C氧化酶亚基1）、rbcL（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基）及ⅠTS（内转录间隔区）序列。多序列比对显示，2个种群的冬青叶马尾藻的cox1、rbcL序列很保守，未发现多态性位点；而ⅠTS序列变异较大，在碱基组成和序列长度上均有丰富的多态性。根据ⅠTS的序列特征将所分析样品分为A、B和C 3个类群。系统进化分析显示，3个类群能以较高的置信度与数据库中其他地域来源的冬青叶马尾藻聚为一支，其中A、B类群的亲缘关系非常近，而C类群与其他地域来源的冬青叶马尾藻更相似。

褐藻；冬青叶马尾藻；种群；多样性；系统进化

马尾藻（Sargassum spp.）广泛分布于热带和亚热带海域的近岸低潮带和潮下带[1-2]，是褐藻门（Phaeophyta）墨角藻目（Fucales）中一类重要经济海藻[3]，在工业、农业、食品、医药及生态修复等方面都具有广阔的开发与应用前景[4-9]。

马尾藻属是墨角藻目中形态和分类最为复杂的属之一[3]，属以下可再细分为亚属、组、亚组、系等分类阶元。传统的马尾藻分类主要依据其外部的形态特征，如叶、气囊、生殖托以及初生分枝、次生分枝等进行区分[10-11]，然而由于马尾藻的形态易随时间、环境等因素的影响而变化，甚至有些种类在个体间的变异很大，导致马尾藻属的物种分类非常困难。迄今为止，马尾藻属有记录的物种（包括同种异名）已有近1 000个，但是被证实的物种仅353个[12]。

冬青叶马尾藻（S.ilicifolium）是马尾藻属分布较为广泛的物种之一，印度尼西亚、爪哇、马来西亚、澳大利亚及我国台湾、海南等地均有报道[1]。冬青叶马尾藻能有效吸附重金属元素[13-14]，并且其活性提取物还具有良好的镇痛消炎作用和抗氧化、抗肿瘤等作用[15-16]，因此在生态修复和医药等领域都有很大的应用潜力。

在传统的分类中，冬青叶马尾藻隶属于真马尾藻亚属刺托组冬青叶系（S.sect.Acanthocarpicae，ser.Ilicifolia）[1,17]。随着DNA条形码技术在马尾藻分类鉴定中的应用，研究者发现刺托组物种具有明显的多系性，因此建议对该组内物种形态鉴定的主要依据进行修订，并对刺托组以下的分类阶元进行重新划分[17-18]。Mattio等[17]结合形态鉴定及分子系统学研究结果，提出了针对刺托组的修订方案，其中包括将冬青叶系（S.ser.Ilicifoliae）提升为冬青叶组（S.sect.Ilicifoliae）的建议。

海南的马尾藻资源非常丰富，冬青叶马尾藻是其中较为常见的一种。由于对其资源分布规律和遗传多样性的认识十分有限，目前海南的马尾藻资源并没有得到很好的应用。为研究海南省冬青叶马尾藻不同地理种群的多样性，笔者从长坡镇和潭门镇采集了冬青叶马尾藻样品，测定其cox1、rbcL及ⅠTS的序列，并对其种群的多样性和系统进化关系进行分析，以期丰富对海南省冬青叶马尾藻遗传多样性的认识，以及为进一步研究冬青叶马尾藻的系统进化提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理

本研究的马尾藻实验材料，TM1～TM6采集于海南省潭门镇，CP1～CP6采集于长坡镇。样品采集时，选择成熟、完整的藻体，连同固着器将整个藻株一起铲下。用海水反复冲洗，去除表面附着的泥沙、杂藻及多毛类、甲壳类等动物后，带回实验室暂养，以便形态鉴定及DNA提取。

1.2 马尾藻基因组DNA提取

将马尾藻的藻体清洗干净，选取约1.0 g新鲜幼嫩的藻叶，吸干表面水分后，用液氮充分研磨。根据改良的 CTAB 法提取马尾藻基因组DNA[19]。

1.3 PCR扩增与序列测定

将马尾藻基因组DNA的浓度稀释至50ng/μL，以作为PCR反应的模板。cox1、rbcL及ⅠTS的扩增引物如表1。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

用10mg/mL琼脂糖凝胶电泳对PCR反应产物进行检测，并利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）进行回收。回收产物与pMD18-T载体（大连宝生物有限公司）连接后，转化至大肠杆菌感受态细胞。随机挑选3-5个阳性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.4 数据分析

利用chromas软件检查测序结果的峰图，然后用DNAman软件对序列进行校正和拼接，以获得各基因片段的一致序列。另外，从GenBank数据库中下载马尾藻属部分物种的相关序列、并以喇叭藻属（Turbinaria）的T.ornata作为外群（表2），采用最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统进化树（Bootstrap设为1 000次重复），然后基于Kimura 2-parameter模型计算种间的遗传距离。

表2 GenBank下载的马尾藻物种的序列Table 2 GenBank accession numbers of Sargassum spp.used in the present study

2 结果与分析

2.1 冬青叶马尾藻的cox1、rbcL及ⅠTS的序列多态性

通过PCR扩增和测序，得到12份冬青叶马尾藻样品的cox1、rbcL及ⅠTS序列。其中cox1扩增产物为561 bp，rbcL扩增产物为488 bp；ⅠTS序列为1 498～1 491 bp。通过多序列比对发现12份冬青叶马尾藻样品的cox1和rbcL均非常保守，没有找到多态性位点，并且分别与数据库中冬青叶马尾藻的cox1（GenBank序列登录号：HQ416039）和rbcL（GenBank序列登录号：KF282003）的序列相似性分别达99.9%和100%。而ⅠTS序列的变异相对较大，在序列长度和碱基组成上均发现了较为丰富的多态性。由于目前未见冬青叶马尾藻ⅠTS序列全长的报道，因此对获得的ⅠTS序列进行了重点分析。

2.2 冬青叶马尾藻的ⅠTS序列特征

12份冬青叶马尾藻样品的ⅠTS序列可以分为3类（GenBank序列登录号：KU857032～KU857034），分别标记为ⅠTS-A、ⅠTS-B和ⅠTS-C（表3）。通过与GenBank中其他马尾藻物种的ⅠTS序列进行比对后，确定了ⅠTS1和ⅠTS2的长度范围。

12条冬青叶马尾藻ⅠTS序列的GC含量基本一致，其中ⅠTS1和ⅠTS2的GC含量分别为 57.4%～57.5% 和55.9%～56.3%。ⅠTS-A全长为1 489 bp，包括采自长坡镇的5份和潭门镇的3份冬青叶马尾藻；ⅠTS-B的序列全长为1 490 bp，包括采自潭门镇的另外4份冬青叶马尾藻；此外，长坡镇和潭门镇还各有1份冬青叶马尾藻样品的ⅠTS序列全长为1 488 bp，标记为ⅠTS-C（表1）。与ⅠTS-A相比，ⅠTS-B存在1处碱基颠换（C-A），以及1处单碱基插入（1468位点发生C的插入）；相对于前两种ⅠTS序列，ⅠTS-C的变异较大，共发生1处单碱基丢失和6处碱基变异（图1）。发生变异位点多分布在ⅠTS1区（66.7%），而5.8s 极为保守，未出现变异位点。根据ⅠTS序列的种类将本研究的冬青叶马尾藻样品分成A、B和C 3个不同的类群，以便于后续的系统进化分析。

表3 不同类群的冬青叶马尾藻的ⅠTS序列特征及样品来源信息Table 3 Features ofⅠTS sequences and sample information of different S.ilicifolium types

2.3 系统进化分析

目前 GenBank数据库中马尾藻属物种的序列信息十分有限，仅7个物种同时检索到了ⅠTS2、cox1和rbcL 3个片段的序列信息。由于ⅠTS2序列是马尾藻属的系统进化分析中最常用的标记之一，有序列信息的物种相对丰富，且大多具有凭证标本作为验证，增加了数据的可靠性。因此本研究分别采用3个基因片段联合分析和ⅠTS2序列单独分析两种方法，与数据库中的参考序列进行了比对，并以喇叭藻属（Turbinaria）作为外群，采用最大似然法构建系统进化树（图2—3）。结果显示，两种方法构建的系统进化树中，不同的冬青叶马尾藻均能优先聚为一支，其中A、B类群首先聚在一起，说明它们之间的亲缘关系更近；另外，叶囊马尾藻（S.phyllocystum）也显示出与冬青叶马尾藻之间较近的亲缘关系。不同的是，在3个片段联合构建的系统进化树中，匍枝马尾藻（S.polycystum） 与冬青叶马尾藻之间的亲缘关系很远，而在以ⅠTS2联合构建的系统进化树中，两者的亲缘关系较近。

图1 三种冬青叶马尾藻的ⅠTS序列比对Fig.1 Alignment of three types of S.ilicifoliumⅠTS fragments

图2 基于ⅠTS2-cox1-rbcL序列的系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based onⅠTS2-cox1-rbcL sequences

图3 基于ⅠTS2序列的系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis based onⅠTS2 sequences

基于Kimura 2-parameter模型计算各马尾藻的种间遗传距离，结果显示，利用ⅠTS2计算的遗传距离比利用cox1、rbcL及ⅠTS2这3个片段计算的平均遗传距离略大（表 3）。海南的冬青叶马尾藻3个类群中，A、B类群的之间的遗传距离最小，平均遗传距离为0.000，它们与C类群的平均遗传距离为0.003；而C类群与数据库中冬青叶马尾藻亲缘关系较近，平均遗传距离为 0.003。与所分析的其他马尾藻属物种相比，冬青叶马尾藻与叶囊马尾藻的平均遗传距离较近，为0.019～0.031；与瓦氏马尾藻（S.vachellianum）的平均遗传距离相对较远，为0.054～0.078（表4）。

表4 不同马尾藻的种间遗传距离Table 4 Pairwise genetic distances between different Sargassum species

3 讨论

3.1 不同冬青叶马尾藻地理种群的多样性

ⅠTS、cox1和rbcL等是藻类分子系统学研究中应用较多的基因片段。其中ⅠTS因进化速度相对较快，已广泛用于大型藻类近缘种、甚至同物种不同种群间的系统进化分析[23]，并且在马尾藻属物种的研究中也逐渐应用起来[24-27]；此外，分别位于线粒体和叶绿体的cox1和rbcL基因，因具有引物通用性强且变异速率适宜的优点，也被认为是较为理想的DNA条形码标记[28-29]。本研究利用这3个片段对海南省2个地理种群的冬青叶马尾藻的遗传多样性进行了初步分析。其中cox1和rbcL未能找到变异位点，而ⅠTS序列在长度和碱基组成上均发现了较为丰富的多态性。其原因可能是cox1和rbcL分别在呼吸作用和光合作用中起着重要的作用，承受的选择压力比非编码的ⅠTS略大，因而在种内的分辨率不够高。

本研究根据ⅠTS序列将2个地理种群的冬青叶马尾藻样品分为3个类群。系统进化分析显示，与C类群相比，A、B类群间的亲缘关系更近；而C类群与数据库中来源于南太平洋新喀里多尼亚的冬青叶马尾藻（凭证标本编号；ⅠRD1617）[17]更相似。但是，由于目前具有来源和凭证标本信息的马尾藻的数据非常有限，笔者暂时无法对海南的冬青叶马尾藻的与其他地域来源的样品之间的关系进行进一步研究。

3.2 冬青叶马尾藻的分类地位

在墨角藻目中，马尾藻属是物种最为丰富，分类最为复杂的属之一。目前，马尾藻属被分为真马尾藻亚属（S.subgen.Sargassum）、反曲叶亚属（S.subgen.Bactrophycus）、节叶亚属（ S.subgen.Arthrophycus）和叶枝亚属（S．subgen．Phyllotrichia）4个亚属，其中以真马尾藻亚属的物种最为丰富多样[10]。在传统的分类中，冬青叶马尾藻是真马尾藻亚属刺托组冬青叶系的代表性物种。本研究利用两种方法构建的系统进化树中，不同地域来源的冬青叶马尾藻物种都能首先聚在真马尾藻亚属的一个小分支内，这与形态学分类的结果一致，也暗示这些冬青叶马尾藻的起源可能具有单系性。

此外，本研究中利用两种方法构建的系统进化树显示，传统分类上同属于刺托组的硬叶马尾藻和冬青叶马尾藻均位于不同的分支，印证了刺托组物种为多系发生的观点[17，18]。由于具有ⅠTS2序列的物种信息相对丰富，从本研究利用ⅠTS2序列构建的系统进化树可以看出，硬叶马尾藻与瓦氏马尾藻在同一个分支，且此分支与冬青叶马尾藻所在的分支处于并列的地位，因此进一步支持了Mattio等[17]提出的将冬青叶系提升为冬青叶组（S.sect.Ilicifoliae），以及将原来属于刺托组的硬叶马尾藻划分到新组S.sect.Binderianae的建议。

3.3 马尾藻传统分类和分子分类中存在的问题

本研究中利用3个基因片段和ⅠTS2分别构建的系统进化树上，除了匍枝马尾藻所处的位置变化较大之外，其他物种的聚类结果基本一致，但是利用3个基因片段构建的系统进化树的支持度比ⅠTS2序列单独构建的略高，可见多基因片段联合分析有利于提高分析结果的准确性。另外，利用ⅠTS2序列的系统进化分析显示山德马尾藻（S.sandei）与冬青叶马尾藻聚在一个小分支内，在传统分类中，山德马尾藻和冬青叶马尾藻同属于冬青叶系，该结果证实了它们之间的亲缘关系非常近，但也说明依靠单一标记对马尾藻近缘物种进行分辨时具有一定局限性。

此外，在ⅠTS2序列构建的系统进化树上，冬青叶马尾藻重缘变种（S.ilicifolium var.conduplicatum）没有与冬青叶系的物种聚在一起，而与硬叶马尾藻（S.aquifolium）和斯氏马尾藻（S.swartzii）显示出较近的亲缘关系，这与传统分类不一致。但由于数据库中没有冬青叶马尾藻重缘变种的其他基因序列信息，笔者无法对其与冬青叶马尾藻的近缘关系做进一步分析。

由于马尾藻物种的形态变异很大，依据其形态特征的分类系统中一直存在很多有争议的问题，因而出现分子分类和传统分类不一致的现象也比较常见。随着分子系统学研究在马尾藻分类学中越来越多地应用，传统的马尾藻属分类系统发生了一些重大改变，如对先前的一些分类标准进行重新评估，以及去除一些不合理的分类方法等[17-18,30]。但是，由于目前还没有确定适合于马尾藻分子系统学研究的分子标记，马尾藻物种的准确分类和其系统演化关系的明确，还需要进行大量的工作。

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（责任编辑：陈庄）

Diversity and phylogenetic analysis of two populations of Sargassum ilicifolium（Fucales,Phaeophyceae）in Hainan

ZOU Xiao-xiao,LⅠU Xin-xin,ZHU Jun,LⅠN Yong,HUANG Hui-qin,BAO Shi-xiang
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropic Agriculture Science，Haikou 571101,China）

Ⅰn order to understand diversities among different geographic populations of Sargassum ilicifolium in Hainan，12 S.ilicifolium individuals were collected from Tanmen and Changpo Town，then sequences of cox1,rbcL andⅠTS were obtained through PCR amplification and sequencing.Multiple sequence alignment showed that cox1 and rbcL were conserved among the 12 individuals，and no polymorphism site were found within the two populations；but relative abundant polymorphisms were identified both in variation of the length and base composition among differentⅠTS sequences.Thus，the 12 S.ilicifolium individuals were divided into three groups（A，B and C） based on variations among theirⅠTS sequences.Phylogenetic analysis revealed that the three groups were first clustered together with S.ilicifolium individuals from other regions of the world.Additionally，groups A and B were more closely related to each other；but group C showed a closer genetic relationship with other geographic individuals of S.ilicifolium.

Brown algae；Sargassum ilicifolium；genetic diversity；populations；phylogenetic relationships

Q949.28; S932.7

A

1673-9159（2016）06-0021-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.004

2016-05-10

海洋公益性行业科研专项（2014050402）；海南省自然科学基金（20163119）；国家海洋经济创新发展区域示范项目（12PYY001SF08）；海南省科技兴海专项（XH201408）；海南省重点实验室和工程技术研究中心建设专项（sys2014005）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（ⅠTBB2015RC07、1630052015038）

邹潇潇（1983—），女，博士，助理研究员，研究方向为藻类生物学。E-mail：zouxiaoxiao@itbb.org.cn

鲍时翔，男，研究员，研究方向为藻类生物学。E-mail：baoshixiang@itbb.org.cn