盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学及残留消除规律

汤菊芬，蔡 佳，黄 瑜，廖建萌，黄月雄，简纪常

（1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东 湛江 524088；3.湛江市食品药品检测所，广东 湛江 524022）

盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学及残留消除规律

汤菊芬1,2，蔡 佳1,2，黄 瑜1,2，廖建萌3，黄月雄1,2，简纪常1,2

（1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东 湛江 524088；3.湛江市食品药品检测所，广东 湛江 524022）

在水温（28±2）℃、盐度28 条件下，将盐酸氯苯胍（Robenidine hydrochloride,ROBH）按30mg/kg 的剂量口灌红笛鲷（Luthjanus sanguineus），用HPLC-MS/MS法研究ROBH在红笛鲷体内的药代动力学和残留消除规律。结果表明：单剂量口灌给药后，红笛鲷血浆中ROBH的药时数据符合一级吸收二室模型，药物在血浆中的达峰时间tp为1.79 h，血药浓度峰值Cmax为211.38 μg/L，药时曲线下面积（AUC0-∞）为5 229.16 μg/(L·h)，消除半衰期（t1/2β）为46.99 h。ROBH在红笛鲷其他组织中分布较广，消除速度较慢，肌肉、肝脏和肾脏的Cmax分别为37.58、863.02、1 063.24 μg/kg，tp均为1.5 h，AUC0-∞分别1 017.03、20 841.20、30 743.04 μg/(kg·h)；t1/2β分别为26.35、14.05和24.31 h。连续5 d口灌给药后，红笛鲷血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的药物消除半衰期t1/2分别为46.14、36.11、28.62、26.92 h。以10µg/kg为最高残留限量，肌肉作为食用靶组织，在本试验条件下，建议休药期不少于7 d。

盐酸氯苯胍；红笛鲷；药代动力学；药物残留；消除

盐酸氯苯胍（Robenidine hydrochloride，ROBH）化学名称1,3-双（对氯苯叉氨基）胍盐酸盐，属胍基衍生物，分子式C15H14Cl3N5，相对分子质量370.67，可影响球虫ATP，干扰蛋白质代谢，是一种抗球虫药，具有广谱、高效、低毒、安全、适口性好等特点，对鸡、兔的急、慢性球虫病有良好疗效。盐酸氯苯胍在水产养殖上主要用于防治鱼类的孢子虫病[1-2]。目前，对盐酸氯苯胍的研究主要集中在残留检测方面，其检测方法主要有高效液相色谱法[3-5]、液质联用法[6-9]等。ROBH在水产动物体内的药代动力学和残留消除研究尚未见报道。本研究以红笛鲷（Luthjanus sanguineus）为试验对象，研究ROBH在其体内的药代动力学和残留消除规律，为ROBH在鲷科鱼类养殖中的规范应用提供理论依据。

1 材料与方法

试验用鱼购自湛江市南三岛张高仪老板鱼排，在广东海洋大学东海岛实验基地暂养1周，经检测确认体内无ROBH残留。挑选健康、规格整齐 [体质量（256.35±9.18）g]的鱼进行试验。

试剂：ROBH标准品，纯度98.5%，购自美国JK；甲醇、甲酸，色谱级；乙酸、无水硫酸钠等均为分析纯。

主要仪器液相色谱-质谱联用仪（配有ESⅠ源），美国Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 ROBH标准溶液配制 用甲醇将ROBH标准品准确配制成1.0mg/mL，再用甲醇稀释100倍，配制成质量浓度10µg/mL的标准储备液，于–4℃冰箱储存备用。

准确量取ROBH标准储备液，用体积分数50%的甲醇溶液分别稀释成1、2、5、10、20、50、100、250、500、1 000ng/mL等10个质量浓度梯度的标准工作液。

1.2.2 色谱条件 色谱条柱：Thermo Fisher Hypersil Gold C18(150mm×2.1mm，5μm )；进样体积：10 µL；柱温：30℃；流动相：A为甲醇，B为5 mmol/L乙酸铵（含体积分数0.1%甲酸）；流速：300 µL/min。洗脱程序见表1。

作为与医学相关联的学科，药学教育的目标是培养从事药物研发和药学服务的专业人才。目前世界多国为加强药学生的职业责任感，均采用了宣誓仪式。

1.2.3 质谱条件 参照文献[10]稍加修改：喷雾电压4 500 Ⅴ，鞘气压力45 kPa，辅助气压10 kPa，毛细管温度350℃，碰撞压200.0 mPa。质谱参数见表2。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program %

表2 盐酸氯苯胍的保留时间和质谱条件Table 2 HPLC retention time and optimized MS/MS conditions for ROBH

1.2.4 给药及样品采集 药物代谢组：将红笛鲷（试验前停饲24 h）随机分成15个组（分别与采样时间点对应），每组10尾鱼置于一个0.3 m3的玻璃桶中，另取鱼数尾作为空白对照组。ROBH按30mg/kg剂量口灌实验鱼，于给药后的 0.15、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120 h时，每组取鱼5尾，尾静脉采血后快速取其肝脏、肾脏和背部肌肉。每尾鱼血液于肝素钠处理的离心管中，以5 000 r/min离心8min，取上清液于–20℃冰箱保存。肝脏、肾脏、肌肉分别于无菌离心管中，置–20℃冰箱保存备用。

残留消除组：红笛鲷随机分成7组，每组鱼10尾，按30mg/kg剂量连续口灌ROBH 5 d，分别在最后1次给药后0.5、1、2、3、5、7、10 d采样，采样方法同药物代谢组。

1.2.5 样品处理 参照文献[8-9]稍加修改：血浆和各组织在室温下自然解冻，取血浆1mL，肌肉、肝2.0 g，肾脏0.2 g，剪碎，分别于离心管中，依次加入5mL甲醇（含体积分数1%甲酸）、4 g无水硫酸钠，涡旋振荡，超声15min，以4 000 r/min离心10min，吸取上层清液后，残渣重复上述操作1次，合并上清液，在40℃水浴中用氮气吹干。用5.0mL甲醇溶解残渣，涡旋振荡，超声15min，以4 000r/min离心10min，上清液用0.22 µm微孔滤膜过滤，滤液待上机检测。

1.2.6 线性范围和检测极限测定 选质量浓度为1、2、5、10、20、50、100、250、500、1000ng/mL等10个标准工作液，按照1.2.2、1.2.3所确定的实验条件，以峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标进行线性回归。

1.2.7 回收率和精密度测定 采用加标回收法，在空白样品（血浆、肌肉、肝脏、肾脏）中分别加入5、50、100ng/mL的ROBH标准溶液，再按1.2.5处理样品，每个浓度做6次平行。

1.2.8 数据处理 用Excel2003处理药时数据，模型的拟合和参数推算用DAS3.0软件处理。

2 结 果

2.1 方法验证

2.1.1 线性范围和检测极限 ROBH为1～1 000ng/mL时，峰面与质量浓度有良好线性关系（图1）。以3倍信噪比计算，检出限为0.001mg/kg。

图1 ROBH标准曲线Fig.1 Standard curve of ROBH

2.1.2 回收率和精密度 表3可见，ROBH在添加水平5、50、100ng/mL时，各组织加标平均回收率为 88.85%～116.78%，相对标准偏差为 2.96%～9.15%，说明样品处理方法稳定，重现性好，可满足各组织中样品检测要求。

表3 红笛鲷空白组织添加盐酸氯苯胍的回收率和精密度Table 3 Recovery and accuracy of ROBH in blank tissues of Luthjanus sanguineus

2.2 ROBH在红笛鲷各组织中的药–时曲线

红笛鲷按30mg/kg口灌ROBH后，药-时曲线见图2。从图2可见，各组织中的药-时曲线均呈双峰现象，出峰时间（tp）血浆中分别为1.5和6 h，肌肉中分别为1.5和8 h，肝脏中分别为1.5和12 h，肾脏中为 1.5和 8 h，药物峰值 cmax血浆中分别为235.77和201.51 μg/L，肌肉中分别为37.58和 33.23 μg/kg，肝脏中分别为863.02和702.47 μg/kg，肾脏中分别为1 063.24和975.48 μg/kg。

图2 红笛鲷口灌ROBH后组织中的药 –时曲线Fig.2 Concentration-time curve of ROBH in tissues of Luthjanus sanguineus after oral administration

2.3 ROBH在红笛鲷血浆中的药代动力学参数

经DAS3.0软件分析，ROBH血浆的药 –时数据符合一级吸收二室模型，理论方程为C=290.17 e–0.12t+ 27.91 e–0.02t–318.08 e–1.09t，药动学参数见表4。

2.4 ROBH在红笛鲷其他组织中的药代动力学参数

推算的ROBH在红笛鲷体内组织中药动学参数见表5。cmax和AUC0-∞：肾脏＞肝脏＞肌肉；MRT0-∞：肌肉＞肾脏＞肝脏；t1/2：肌肉＞肾脏＞肝脏。说明ROBH主要分布于肾脏和肝脏，在肌肉中平均驻留时间最长，消除半衰期明显高于肾脏和肝脏。

表4 红笛鲷口灌ROBH后血浆中的药代动力学参数Table 4 Pharmacokinetic parameters in plasma of ROBH after oral administration to L.sanguineus

表5 红笛鲷口灌ROBH后组织中的药代动力学参数Table 5 Pharmacokinetic parameters in tissues of ROBH after oral administration to L.sanguineus

2.5 ROBH在红笛鲷体内的消除

连续口灌5 d的药物消除曲线见图3，曲线方程及相关参数见表6。图3和表6可见，ROBH残留量在肌肉中最低，肾脏中最高。t1/2：肌肉＞肝脏＞肾脏＞血浆，说明ROBH在红笛鲷肌肉中消除最慢。

图3 连续口灌5 d后组织药物的消除曲线Fig.3 Elimination curve of ROBH in plasma and tissues of L.sanguineus after oral administration for five consecutive days

表6 ROBH在红笛鲷组织中的消除规律及参数Table 6 Equation of elimination curve and parameters of ROBH in tissues after oral administration to L.sanguineus

3 讨 论

3.1 ROBH在红笛鲷组织中的药–时曲线特征

红笛鲷以30mg/kg单剂量口灌ROBH后，血浆和组织中的药时曲线均出现明显的双峰现象。目前，关于口服药物 c–t曲线的双峰现象报道较多，认为引起该现象的主要原因是肝肠循环和非齐性吸收，两峰相隔时间2～20 h[11-13]。药物进入十二指肠后，可在小肠重吸收返回肝脏，形成肝肠循环，引起双峰现象。口服药物进入体内时，需经过胃肠道上、下两个部位吸收，由于胃肠道的不同部位和管壁对药物的通透性不同，也可导致双峰现象[14]。此外，还可能与药物的分布、重吸收有关，即当其他组织的药物浓度高于血浆时，药物可能转移至血浆而引起血浆的另一个高峰[15]。由图2可见，ROBH在吸收阶段，肝脏和肾脏中的药浓度明显高于血浆，此时肝脏和肾脏中的ROBH可能转移至血浆中，再随血液分布于其他组织中而产生第2个浓度峰。

3.2 ROBH在红笛鲷体内的药代动力学特征

ROBH为驱虫渔药，目前尚未见ROBH在水产动物体内药代动力学的研究报道。本研究在水温（28 ±2）℃、盐度28 条件下，将ROBH按30mg/kg的剂量口灌红笛鲷后，红笛鲷血浆中的药时数据符合一级吸收二室模型，其血浆、肌肉、肝脏、肾脏中的药物浓度均在1.5 h左右出现第1次峰值，cmax分别为211.380 0µg/L、37.58µg /kg、863.02µg/kg、1 063.24µg/kg，AUC0-∞分别为：5 229.16µg/(L·h)、1 017.03µg/(kg·h)、20 841.20µg/(kg·h)、30 743.04µg/(kg·h)，说明ROBH口灌给药时在红笛鲷体内吸收较为缓慢，药物多分布于肝脏和肾脏，血浆和肌肉中分布较少，大部分药物经肝脏和肾脏直接排出。

t1/2β和MRT0-∞是反映药物在动物体内消除快慢的重要参数。红笛鲷单剂量口灌 ROBH后， t1/2β依次为：血浆（46.99 h）＞肌肉（26.35 h）＞肾脏（24.31 h）＞肝脏（14.05 h），MRT0-∞依次为：血浆（129.72 h）＞肌肉（41.29 h）＞肾脏（39.19 h）＞肝脏（27.62 h），说明ROBH在红笛鲷体内血浆和肌肉中消除较缓慢，驻留时间较长。

3.3 连续口灌5 d后ROBH在红笛鲷体内的残留消除及休药期

红笛鲷连续5 d口灌给药后，组织中的药物残留浓度依次为：肾脏＞血浆＞肝脏＞肌肉，药物t1/2β依次为：肌肉（46.14 h）＞肝脏（36.11 h）＞肾脏（28.62 h）＞血浆（26.92 h），表明ROBH在红笛鲷体内消除较为缓慢，肌肉中残留消除最慢。班付国等[16]研究鸡连续饲喂含500mg/kg氯苯胍的饲料7 d后停药，在停药后第3天，肌肉组织未检出氯苯胍残留，第5天各组织的残留量均低于文献[17]的规定，且残留量脂肪中最高，其次为肝脏，肌肉中最低，表明氯苯胍在鸡体内残留消除较为缓慢。本研究结果与班付国等的结果基本一致，但ROBH在红笛鲷体内的消除速度比氯苯胍在鸡体内的慢，可能与研究对象对药物的代谢速度不同有关。

目前，中国、欧盟及美国等均制订了氯苯胍在动物源食品中的最高残留限量。2002年，我国规定ROBH在鸡脂肪、皮及其他可食用组织中的最高残留限量（MRL）分别为 200、200、100µg/kg[17]。中国和欧盟等对水产品中 ROBH暂无明确的残留限量要求。根据日本 2006年实施的食品中农业化学品残留“肯定列表制度”要求，对于未制定最大残留限量标准的农业化学品在食品中含量不得超过10µg/kg，对于已建立最高残留限量标准的化学物质则在食品中含量不得超过最高标准[18]。本研究将ROBH的最高残留限量暂定为10µg/kg，以肌肉作为食用靶组织，停药后5 d时肌肉中的药物浓度为 2.57 μg/kg，已低于设定的最大残留限量，鉴于本研究未检测鱼皮中的药物含量，为确保消费者的安全，将休药期适当延长。因此，在本试验条件下，建议ROBH在红笛鲷体内的休药期至少为7 d。

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（责任编辑：刘庆颖）

Pharmacokinetics and Elimination Regularity of Robenidine Hydrochloride Residues in Luthjanus sanguineus

TANG Ju-fen1,2,CAⅠ-jia1,2,HUANG Yu1,2,LⅠAO Jian-meng3,QⅠN Qing-ying1,2,
HUANG Yue-xiong1,2,JⅠAN Ji-chang1,2
(1.Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088,China; 3.Zhanjiang Food and Drug Inspection Institute,Zhanjiang 524022,China)

The pharmacokinetics and elimination regularity of Robenidine hydrochloride (ROBH) residues were investigated in tissues of Luthjanus sanguineus with a 30mg/kg body weight after oral administration at the water temperature of (28±2)℃ and salinity of 28 by HPLC-MS/MS method.The results showed that the date of ROBH concentration-time in plasma of L.sanguineus could be described as a two-compartment model with first-order absorption.The peak time (tp) was 1.79 h,and the maximum concentration (Cmax) was 211.38 μg/L,the area under the concentration-time curve(AUC0-∞) was 5 229.16 μg/(L·h),and the elimination hal-life (tl/2β) of plasma was 46.99 h.ROBH has a wide distribution in organizations of L.sanguineus and eliminated slowly.The Cmaxin muscle,liver and kidney were 37.58,863.02 and 1 063.24 μg/kg; tpwere all 1.50 h; AUC0-∞were 1 017.03,20 841.20 and 30 743.04 μg/(kg·h); tl/2βwere 26.35,14.05 and 24.31 h,respectively.After oral administration continuous with 30mg/kg dose for 5 days,the t1/2in plasma,muscle,liver and kidney of L.sanguineus were 46.14,36.11,28.62,and 26.92 h,respectively.Ⅰf the maximum residue limits (MRL) is 0.01mg/kg and the muscles as the edibletarget tissue,the withdraw period should not be less than 7 days under this experiment condition.

Robenidine hydrochloride; Luthjanus sanguineus; pharmacokinetics; drug residues; elimination

S943.231

A

1673-9159（2016）06-0033-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.006

2016-05-16

农业部公益性行业专项(20120385)；广东省科技计划（农业攻关）项目（2012B020308010）

汤菊芬（1964－），女，硕士，高级工程师，研究方向为水产动物病害防治。E-mail：tjf10002000@163.com

简纪常（1964-），男，博士，教授，研究方向为水产经济动物免疫学及病害控制。E-mail：jianjc@gmail.com