Taqman荧光PCR法检测肉制品中牛源性成分及定量研究

沙才华，汪文辉，黄海超，廖秀云，杨　素（珠海出入境检验检疫局，广东珠海　519000）

Taqman荧光PCR法检测肉制品中牛源性成分及定量研究

沙才华，汪文辉，黄海超，廖秀云，杨素
（珠海出入境检验检疫局，广东珠海519000）

本研究通过以牛线粒体保守基因序列设计的特异性引物和探针，建立了肉制品中牛源性成分Taqman荧光PCR检测方法，并对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行了评价；通过模拟浓度标准曲线，完成了对牛源性成分的相对定量检测。结果显示，本方法具有特异性强、灵敏度高（检出限为0.001%）的特点，适用于肉制品中牛源性成分及含量的快速检测。

牛源性成分；线粒体；Taqman荧光 PCR

近年来，“假牛肉事件”屡屡曝光，牛肉制品中造假掺杂几乎成为公开的秘密。这些不法行为不仅扰乱了正常的市场秩序，而且造成了食品安全隐患，其影响不容忽视。因此，建立一种对肉制品中牛源性成分进行快速鉴定和定量分析的准确检测方法具有非常重要的意义。

Taqman荧光 PCR技术应用于食品中肉类种源鉴别，这在保证鉴别准确性前提下，使定量检测成为可能。由于Taqman荧光PCR扩增的目的片段较短，所以尤其适用于加工食品的检测。根据被释放的荧光基团数目与PCR产物数量的一对一关系，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，以获得定量结果，进而利用该技术对模板进行准确定量[1]。本研究选定高保守的牛线粒体基因作为靶基因，设计特异引物及探针，旨在建立快速、简便、灵敏、特异的牛源性成分荧光PCR检测方法，从而实现对肉制品中牛源性成分的鉴定和定量，为打击牛肉制品造假掺杂行为提供技术支撑。

1　材料和方法

1.1样品

黄牛肉、水牛肉、牦牛肉、羚羊肉、山羊肉、绵羊肉、马肉、驴肉、双峰驼肉、驯鹿肉、猪肉、猫肉、狗肉、鸡肉、鸭肉为本实验室留存样品。以上样品均已使用本实验室脊椎动物通用引物（经过CNAS认可）对PCR产物进行了测序，确定了其种属。

1.2主要试剂

DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit，美国OMEGA公司产品；Premix Ex Taq qPCR Mastermix，宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.3主要仪器

7500 FAST荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司产品；Sigma 3-18 K高速冰冻台式离心机，德国Sartorius公司产品；NanoDrop ND-1000紫 外 分 光 光 度 计， 美 国 NanoDrop Technologies 公司产品。

1.4方法

1.4.1PCR引物、探针的设计与合成。检索GenBank中公布的大量不同种属的牛（包括黄牛、水牛、牦牛）DNA序列，最终选用牛线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）上的特异性序列作为设计引物与探针的序列。利用生物学软件DNAMAN将其比对后，在高度保守区域用Oligo7.0设计一组牛特异性PCR引物和探针，由大连宝生物科技有限公司合成。引物、探针序列见表1。

表1　牛引物、探针序列

1.4.2样品的DNA提取。按照DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA，利用Nanodrop 1 000微量紫外分光光度计测定样品DNA浓度和纯度。按照所测浓度，将样品DNA 含量稀释至100 ng/µL左右，存于-20 ℃备用。

1.4.3反应体系和反应条件。PCR反应体系为25 µL：2×Taq PCR Master mix 12.5 µL、10 µmol/L上下游引物各2 µL、10 µmol/L探针1 µL、DNA模版2.0 µL，补水至25 µL。反应程序：95℃4 min；95℃15 s，50℃1 mins，40个循环。FAM荧光通道搜集信号，在每个循环的退火阶段收集荧光信号。结果判定：Ct值小于35，且曲线有明显的对数增长，判为阳性；Ct值大于35，判为阴性。

1.4.4荧光PCR方法特异性试验。以黄牛肉、水牛肉、牦牛肉等3份牛源性样品和羚羊肉、山羊肉、绵羊肉、马肉、驴肉、双峰驼肉、驯鹿肉、猪肉、猫肉、狗肉、鸡肉、鸭肉等12份非牛源动物样品提取的DNA为模板，进行荧光PCR扩增，验证所建立的荧光PCR方法的特异性。

1.4.5荧光PCR方法灵敏度和稳定性试验。以新鲜牛肉去脂肪后切片，经烘箱60 ℃ 72小时烘干，然后研磨成牛肉粉，称取30 mg牛肉粉按照1.4.2所述方法提取牛DNA模板，用灭菌双蒸水10倍比稀释至10-9，每个梯度的样品取5个平行进行荧光PCR扩增，计算各稀释度样品Ct平均值（）和相对标准偏差（RSD）评价该方法灵敏度及稳定性。

1.4.6模拟混合样荧光PCR方法灵敏度和稳定性试验。使用1.4.5制备的纯牛肉粉和纯鱼粉按10倍比稀释混合至10-9，称取30 mg混合粉提取DNA模板，每个梯度的样品取5个平行进行荧光PCR扩增，计算各稀释度样品Ct平均值和相对标准偏差（RSD）评价该方法灵敏度及稳定性。

1.4.7标准曲线的建立及模拟混合样品中牛源性成分定量检测。使用1.4.5制备的纯牛肉粉和纯鱼粉按不同比例混合，制成牛源性成分含量分别为100%、50%、25%、10%、5%及1%（m/m）的系列浓度标准样本，标准样品取5个平行。同时模拟加工混合肉样的检测，对牛肉粉含量分别为2%、4%、8%、20%、40%和80%的混合样品进行定量体系检测，每个样品取2个平行。每份样品称取30 mg混合粉提取DNA模板，进行荧光PCR扩增，通过ABI荧光PCR仪软件设定标准对照，反应结束后，直接点击“analysis”进行分析，软件自动给出标准曲线（包括线性关系、斜率、扩增效率等）及各样品计算浓度。也可以每个浓度的值为横坐标，log2（浓度）的绝对值为纵坐标绘制散点图，生成标准曲线，推导公式并计算各模拟加工混合肉样含量。

1.4.8市售商品的检测。应用本方法和国标

GB/T 20190—2006（普通PCR）中的方法，同时对收集的10份标称为牛肉制品的商品开展牛源性成分检测。

2　结果与分析

2.1牛源性成分荧光PCR方法特异性试验

上述16种不同物种的检测结果显示：仅黄牛肉、水牛肉和牦牛肉有典型的“S”型扩增曲线且Ct值小于35，而其他样品及空白对照均未有扩增曲线或Ct值大于35，具体结果见图1。

图1　牛源性成分荧光PCR方法特异性试验

2.2牛源性成分荧光PCR灵敏度试验和稳定性试验

对稀释度为100～10-9样品进行荧光PCR试验，结果显示：样品在稀释度在100～10-6稀释度时，Ct值均小于35，且曲线有明显的对数增长，扩增结果具有良好的重复性，其相对标准偏差RSD＜3.5%，当样品在稀释度10-7仍有扩增曲线，但样品Ct值大于35，且相对标准偏差RSD＞3.5%。因此本方法建立的荧光PCR方法灵敏度高达10-6（即0.000 1%，对应的为33.94），也与理论推导出来Ct值吻合。最低检测到的牛肉DNA含量为0.2 pg。本方法的灵敏度和稳定性试验见图2，相关数据见表2。以稀释度对值作图，其线性关系如图3所示。线性相关系数R² = 0.999 6，线性范围为10-6～100（即0.000 1%～100%）。

2.3模拟混合样荧光PCR方法灵敏度和稳定性试验

对稀释度为100～10-9样品进行荧光PCR试验，结果显示：样品在稀释度在100～10-5稀释度时，Ct值均小于35，且曲线有明显的对数增长，扩增结果具有良好的重现性，其相对标准偏差RSD＜3.5%。当样品在稀释度10-6时，样品Ct值大于35，因此本方法建立的荧光PCR方法灵敏度高达10-5（即0.001%，对应的为32.39）。本方法的灵敏度和稳定性试验见图4，相关数据见表3。以稀释度对值作图，其线性关系如图5所示。线性相关系数R² = 0.991 4，线性范围为10-5～100（即0.001%～100%）。

表2　牛源性成分荧光PCR 反应的灵敏度和稳定性试验数据

图2　牛源性成分荧光PCR方法灵敏度和稳定性试验

图3　牛源性成分荧光PCR方法线性关系

图4　模拟混合样牛源性成分荧光PCR方法灵敏度和稳定性试验

表3　模拟混合样牛源性成分荧光PCR 反应的灵敏度和稳定性试验数据

图5　模拟混合样牛源性成分荧光PCR方法线性关系

2.4标准曲线的建立及模拟混合样品中牛源性成分定量检测

应用PCR仪自带软件分析显示：线性相关系数R²= 0.986，线性范围为1%～100%。对牛肉粉含量分别为2%、4%、8%、20%、40%和80%的混合样品进行定量体系检测所得牛肉粉含量平均值分别为2.8%、4.2%、9.1%、21.1%、46.0%和79.7%（图6）。以值为横坐标，以log2（浓度）的绝对值为纵坐标绘制散点图，制备标准曲线，并推导出牛源性成分的含量。公式中的y为牛源性成分含量，x为检测的Ct值。应用公式计算出牛肉粉含量分别为2.9%、4.2%、9.2%、21.0%、45.4%和78.1%，线性相关系数R²= 0.989，线性范围为1%～100%，其线性关系如图7所示。两种方法的定量结果均与实际结果相近，相关数据及定量结果见表4。

图6　标准曲线及模拟混合样品中牛源性成分定量检测

表4　牛源性成分荧光PCR定量结果

2.5市售商品的检测

对10份标称为牛肉的制品同时应用本方法和国标GB/T 20190—2006（普通PCR）进行牛源性成分检测。两种方法的定性检测结果完全吻合，其中6份样品检出牛源性成分，另4份样品未检出牛源性成分。应用本方法进行定量分析，6份检出牛源性成分的样品，其中有5份样品牛肉含量约100%，另1份样品含量约为40%。而普通PCR方法凝胶电泳条带亮度和清晰度基本一致，无法区分样品牛源性成分含量。荧光定量PCR检测结果见图8，普通PCR检测结果见图9。

图7　牛源性成分荧光定量PCR标准曲线线性关系

图8　市售商品荧光定量PCR检测

图9　市商样品普通PCR检测

3　讨论

动物产品的质量安全涉及畜牧业健康发展、公共卫生、宗教信仰、进出口贸易等诸多领域。传统的感官检验和免疫学方法仅能鉴别生鲜肉的种属。肉制品经加工后，因其感官性状、蛋白质成分和其他免疫原性物质被破坏而难以鉴别。DNA比蛋白质的耐热性强，高温处理过的食品中仍能提取出DNA。有资料表明，肉制品经过加工后，即使温度达到141℃，也有足够的DNA可通过实时荧光PCR技术检测到，所以对于经过加工的食物仍具有较强的鉴别能力[2-3]。本次建立的荧光PCR方法扩增曲线具有典型的“S”型，特异性强，稳定性较好，混合肉粉中牛源性成分的荧光PCR方法最低检出限为10-5（即0.001%），高于国标法最低检出限（0.1%）100倍。这与相关报道一致，说明所设计的反应体系和反应条件较好[4-6]。

本研究主要针对国内消费量较高且价格昂贵的牛肉作为研究对象，通过设计特异引物和探针，建立定性及相对定量检测体系，将构建标准曲线的Ct值分别代入公式，得出样品中牛肉含量，以达到甄别恶意造假和掺假的目的[7]。构建标准曲线和日常检测样品的所用方法和实验条件必须完全相同。标准曲线建立后可供多次使用，更改DNA提取方法、更换荧光PCR反应试剂，更新荧光PCR仪或仪器关键配件，必须重新制作标准曲线。也可通过PCR仪自带软件设定标准曲线参数分析各样品计算浓度。在线性范围1%～100%内对6个不同浓度的模拟样品进行定量检测，两种分析方法的定量结果均与实际结果相近，证实该定量体系可以用来检测牛肉粉的含量。

应用Taqman荧光PCR检测方法对抽检的10份标称牛肉的制品进行牛源性成分定量检测，发现5份有掺假造假现象。经使用本实验室脊椎动物通用引物进行扩增，并对PCR产物测序，确定其种属，其中4份含有猪源性成分，1份含有鸭源性成分，说明市场上确实存在以低价肉类加工而成的假牛肉。

本研究建立的牛源性成分Taqman荧光 PCR检测方法特异性强、灵敏度高，可以快速、准确检测畜肉食品中含有的牛源性成分及其含量，能够为质检部门打击不法商贩、维护消费者合法利益提供有力的科学依据。

[1] 王颖，史艳宇，刘金华，等. 荧光定量PCR方法检测畜肉食品中猪源性成分[J]. 食品安全质量检测学报，2013，4（5）：1529-1534.

[2] 冯秀燕，董红霞，魏秀莲，等. 动物源性饲料中牛源和羊源性成分的检测方法[J]. 饲料研究，2006（11）：52-54.

[3] 杨宝华，宗卉，林庆燕，等. 用分子生物学方法鉴别检测动物源性饲料中的牛羊源性成分[J]. 中国畜牧兽医杂志，2002，38（1）：3-5.

[4] 国家质量监督检验检疫总局.饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法：GB/T 20190—2006[S] . 北京：中国标准出版社，2006.

[5] 国家质量监督检验检疫总局.食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法：SN/T 2051—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[6] 赵冉，蔡振鸿，陈永锋，等. 动物产品及饲料中牛源和羊源性成分三重荧光PCR检测方法的建立[J]. 畜牧与兽医，2012，44（7）：18-22.

[7] 于雷，姜艳彬，王海，等. 荧光定量PCR法的优化及其在牛羊源性成分检测中的应用研究[J]. 中国畜牧兽医杂志，2009，45（24）：51-54.

（责任编辑：朱迪国）

Detection of Bovine-derived Materials in Meat Products by Real-time Fluorescent PCR with TaqMan Probe and Its Quantitative Research

Sha Caihua，Wang Wenhui，Huang Haichao，Liao Xiuyun，Yang Su
（Zhuhai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai，Guangdong519000）

According to the conserved sequence of the gene in bovine mitochondria，the specific primers and probes were designed，a real-time fluorescent PCR with TaqMan probe for detecting bovine-derived materials existing in meat products was developed. Then its specificity，sensitivity and stability were evaluated. Through the simulated concentration standard curve，the relative quantitative detection of bovine-derived materials was conducted. Results showed that this method had the characteristics of strong specificity and high sensitivity，by which the lowest detection limit was 0.001%. As a summary，the established method was suitable for rapid detection of bovine-derived materials and content in meat products.

bovine-derived materials；mitochondria；real-time fluorescent PCR with TaqMan probe

TS251.5

A

1005-944X（2016）12-0089-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.024

珠海出入境检验检疫局科技计划项目（ZH2014-21）

汪文辉