可视化2型猪链球菌LAMP检测方法的建立

熊　炜，魏晓锋，王　艳，林颖峥，张　强，李春阳，黄忠荣，胡建华，李　健（. 上海出入境检验检疫局，上海　0035；. 上海实验动物研究中心，上海　003）

可视化2型猪链球菌LAMP检测方法的建立

熊炜1，魏晓锋2，王艳1，林颖峥1，张强1，李春阳1，黄忠荣1，胡建华2，李健1
（1. 上海出入境检验检疫局，上海200135；2. 上海实验动物研究中心，上海201203）

由2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype 2）引起的猪链球菌病（Swine streptococosis）是一种重要的人兽共患疾病，具有高感染率、高死亡率的特点。为加强口岸动物源性产品中2型猪链球菌的现场查验力度，建立了2型猪链球菌LAMP检测方法，并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了测试。通过在LAMP反应产物中加入显色液，提高了对检测结果肉眼判定的准确性，实现了结果判定可视化的目标，有助于在出入境口岸货物查验现场及猪场等一线实验室使用。

2型猪链球菌；环介导等温核酸扩增技术；可视化

猪链球菌病（Swine streptococosis）是由溶血性链球菌引起的人兽共患疾病，猪感染后出现败血性、局灶性淋巴结化脓、关节炎等主要特征。溶血性链球菌还可引起人脑膜炎、败血症等，导致严重疾患，甚至死亡[1-2]。该病分布广泛，发病率较高，败血症型的病死率也较高，因此被我国农业部列为二类动物疫病。该病呈世界性分布，自上世纪50年代以来，在荷兰、英国、加拿大、澳大利亚、新西兰、比利时、巴西、丹麦、西班牙、德国、日本等国家以及我国台湾省先后有报道[3]。本病一年四季均可发生，夏秋季多发。病猪和带菌猪是本病的主要传染源，动物的排泄物、分泌物、血液、内脏器官及关节内均有病原体存在，对病死猪的处置不当和运输工具的污染是造成本病传播的重要因素[4-6]。环介导等温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸检测方法，其特异性和敏感性可以与荧光PCR媲美，同时其检测周期短，操作简便，对检测硬件设备的要求较低，适合于在野外现场使用。目前，该技术已成功应用于口蹄疫、猪瘟等重大动物疫病的检测。本研究通过分析2型猪链球菌的基因序列，设计了多套LAMP引物体系，从中筛选出理想的引物，建立了2型猪链球菌LAMP检测方法，并对方法的特异性、敏感性进行了测试，并实现了对检测结果的可视化判读。

1　材料与方法

1.1主要试剂

ThermoPol缓冲液、Bst DNA聚合酶，购自New England BioLabs公司；dNTP、随机引物、DNA Marker（DL2000），购自Takara公司；甜菜碱（Betaine），购自Sigma公司；超纯水，购自Invitrogen公司。

1.2毒株来源及样品处理

2型猪链球菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV，SD1株）、伪狂犬病毒（PRV，SA215株）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV，H株）、猪圆环病毒2型（PCV-2）等组织和核酸样本以及沙门氏菌和志贺氏菌的培养物为本实验室和上海实验动物研究中心保存。阳性组织样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3 000 g离心15 min，收集上清液待检。

1.3病原核酸的提取

取100 µL待检上清液或20 µL细菌培养物，采 用Qiagen DNA Bloodmini Kit提 取PRV、PCV-2、2型猪链球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的核酸；采用Trizol提取PRRSV、TGEV的核酸，再制备成cDNA备用。

1.4LAMP引物设计

查询Genbank获取2型猪链球菌的基因序列，通过软件分析和比对，确定2型猪链球菌保守的特异性靶序列，使用Primer Explorer和LAMP Designer软件，设计2型猪链球菌的LAMP特异引物（表1）。

表1　2型猪链球菌LAMP引物

1.5LAMP检测体系

LAMP基本的反 应 体 系 为25 µL：1×ThermoPol缓冲液，8 mmol/L MgSO4，1 mol/L甜菜碱，1.4 mmol/L dNTPs，0.2 µmol/L外引物（F3和B3），1.6 µmol/L内引物（FIP和BIP），0.8 µmol/L环引物（LF和LB），2 µL模板DNA，8 U Bst聚合酶。将除模板外的其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23 µL，加入10 µL密封液后再分别加入2 µL模板DNA或阴阳性对照模板，混匀离心，小心盖紧管盖。最后将混合物置于反应孔中，于63 ℃恒温反应60 min。

2　结果

2.12型猪链球菌LAMP特异性引物组的筛选

针对2型猪链球菌不同的保守基因序列，共设计了8套LAMP引物。将这些引物放入相同的LAMP反应体系中进行测试，以评估不同LAMP引物体系扩增的效果。结果显示，8套引物中，引物组1和引物组6有扩增，其他无扩增，其中引物组6扩增效果最好，其起峰早，扩增效率高（图1）。

图1　2型猪链球菌不同LAMP引物组扩增曲线

2.22型猪链球菌 LAMP检测方法的灵敏度

将提取的2型猪链球菌基因组DNA分别稀释到0.5×10-2、0.5×10-3、0.5×10-4、0.5×10-5ng/µL，以不含目的基因的水为空白对照，加入引物组6，按照上述反应条件进行LAMP扩增。结果显示，DNA模板量的下限达0.5×10-4ng/µL时，荧光强度和电泳检测仍可见目的条带的显著扩增（图2）。

2.32型猪链球菌LAMP检测方法的特异性

配置含引物组6的LAMP体系反应管，除加入2型猪链球菌核酸外，其余管分别加入PRRV、PRV、TGEV、PCV-2、沙门氏菌、志贺氏菌等病原的核酸，63 ℃运行60 min，电泳判定结果。结果显示，除含有2型猪链球菌核酸的反应管外，其余病原均未出现LAMP特征性的阳性电泳条带（图3）。

图2　2型猪链球菌LAMP检测方法的灵敏度

图3　2型猪链球菌LAMP检测方法的特异性

2.4可视化2型猪链球菌LAMP检测方法

将提取的2型猪链球菌基因组DNA分别稀释到0.5×10-2、0.5×10-3、0.5×10-4ng/µL， 再 加 入LAMP检测体系中。配完检测体系后，在检测管的管盖上滴加2 µL显色液，小心盖好反应管盖，63℃运行60 min。反应结束后，反应管颠倒混匀，肉眼判读结果。结果显示，DNA模板浓度等于或高于0.5×10-4ng/µL时，反应液显浅绿色，而空白对照反应液均呈浅黄色（图4），与前述的结果保持一致。

图4　可视化2型猪链球菌LAMP检测方法

3　讨论

链球菌种类多，属条件性致病菌，在自然界和猪群中分布广泛，常存在于健康的哺乳动物和人体内。2005年6月中旬至8月初，四川资阳、内江等地发生一起较大规模的人-猪链球菌病疫情，疫情分布在l2个市37个县（市、区） 的131个乡镇（街道）、195个村（居委会），造成大量的人员感染和死亡[7]。

猪、野猪、马属动物、牛、羊、狗、猫、鸟类、兔、水貂和鱼等对猪链球菌均有易感性。猪则不分年龄、品种和性别，均易感，但主要在3～12周龄的仔猪中暴发流行，尤其在断奶及混群时易出现发病高峰[8-9]。开发核酸检测方法，在感染早期检出猪链球菌，对控制其传播、减少损失具有重要的意义[10]。

本研究在分析2型猪链球菌保守基因序列的基础上，设计和测试了多套不同LAMP引物检测体系，从中筛选出了一组较理想的引物，建立了2型猪链球菌LAMP检测方法，并对方法的特异性和敏感性进行了测试，证实了建立的LAMP检测方法具有良好的敏感性。同时该方法特异性好，不与PRRV、TGEV、PRV、PCV-2、沙门氏菌、志贺氏菌等病原发生交差反应。

在建立了常规LAMP检测方法的基础上，本研究在密封反应管前滴加显色液于反应管盖上，在温浴反应结束后，再颠倒反应管，让显色液与LAMP产物充分混合，提高了检测结果的可视化，增强了肉眼判定的准确性，同时在不打开反应管的条件下进行染色，避免了扩增产物气溶胶污染检测环境的可能性。

目前，PCR是检测2型猪链球菌的主要方法。该方法具有敏感度高，操作简便的特点，但需要在配有设备的专业化实验室内完成[8-9]。本研究建立的可视化LAMP检测方法，除普通离心机和水浴锅外，几乎不需要其它设备，其检测的敏感性和可靠性不低于传统PCR方法，非常适合应用于猪场等条件简陋的一线实验室早期感染的监控。对于出入境口岸，该方法可应用于货物查验现场动物源性产品中2型猪链球菌的快速检测，有助于提高阳性样品的检出率。

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[3] Goyette-Desjardins G，Auger J P，Xu J，et al．Streptococcus suis，an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing[J]. Emerg Microbes Infect，2014，3（6）：e45.

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[5] 杨珍，王楷宬，范伟兴，等. 表观健康猪群携带猪链球菌情况流行病学调查[J]. 中国人兽共患病学报，2009，25（10）：977-979.

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[9] Gottschalk M，Segura M. The pathogenesis of the meningitis caused by Streptococcus suis：the unresolved questions. [J]. Vet Microbiol，2000，76（3）：259-272.

[10] 赵云玲，王君玮，王华，等. 猪链球菌2型检测技术概述[J]. 中国动物检疫，2009，26（10）：69-70.

（责任编辑：朱迪国）

Establishment of a Visible LAMP Method for the Detection of Streptococcus suis Serotype 2

Xiong Wei1，Wei Xiaofeng2，Wang Yan1，Lin Yingzheng1，Zhang Qiang1，Li Chunyang1， Huang Zhongrong1，Hu Jianhua2，Li Jian1
（1. Shanghai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai200135；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai201203）

Swine streptococosis is caused by Streptococcus suis serotype 2，which is one of the important zoonosis diseases with characteristics of high infection and high mortality rate. In order to strengthen the spot inspection of the Streptococcus suis serotype 2 carried by animal-derived products at each entry-exit port，a loop-mediated isothermal amplification（LAMP） method was established. Then its specificity，sensitivity and stability were tested. With the entry of SYBR Green into LAMP reaction products，the accuracy of the testing results judged by naked eyes has been enhanced，and the objective of visibility of result judging was realized. The LAMP method would offer help to the front-line laboratories，such as in the goods inspection spots belonging to the entry-exit ports and the pig farms.

Streptococcus suis serotype 2；loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；visibility

S851.3

A

1005-944X（2016）12-0075-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.021

上海市科委科研项目（14140900700）

王 艳