家兔血液应用于医疗器械血液相容性评价的可行性研究

杨文润 田胜慧 柯军 广东省医疗器械质量监督检验所 （广州 510080）

家兔血液应用于医疗器械血液相容性评价的可行性研究

杨文润 田胜慧 柯军 广东省医疗器械质量监督检验所 （广州 510080）

由于人血大量使用的限制性，本研究选取3种常用的血液净化医疗器械探讨兔血替代人血在医疗器械血液相容性评价中的可行性。结果表明，3类器械的兔血和人血血液相容性分析结果具有较好的一致性，兔血可替代人血进行血液相容性评价。由于兔血和人血的差异性，补体激活试验只适宜相对结果分析。

血液相容性 兔血 人血 医疗器械

0.前言

血液透析器是血液净化疗法中最常用的医疗器械，因其与人体血液直接接触，属于三类高风险医疗器械，因此该类产品上市之前，医疗器械检测机构要对其进行严格的生物学评价，以避免临床不良事件的发生。2008 年，国家食品药品监督管理局发布了血液透析器的新标准 YY0053-2008《心血管植入物和人工器官－血液透析器、血液透析滤过器、血液滤过器和血液浓缩器》加严了生物学评价方面的要求，增加了细胞毒性、血液相容性、皮内刺激与皮肤致敏等生物学试验。

然而，临床应用的血液净化材料仍然存在直接或间接地导致血液成分的改变或血栓形成的现象，因此，血液相容性评价研究已成为此类材料应用的关键问题之一[1]。判断材料的好坏首先看其是否具备良好的生物相容性，尤其是良好的血液相容性。血液相容性是指材料与血液接触时，无血栓形成、无血细胞破坏、不引起凝血及血小板的粘附和凝聚以及补体的活化。

材料与血液接触时，由于其本身的理化性质，血液各种成分和膜材料之间发生的相互作用，血浆蛋白质首先被吸附在材料表面，并进一步激活血小板、补体和凝血系统，活化白细胞，引起血栓和炎症反应。补体激活是在血液透析过程中经常发生的，也是患者在长期透析后引起残存肾功能衰退、反复发生感染的主要原因。此外，粘附于材料表面的红细胞发生变形、破裂，可导致溶血。因此，血液相容性评价研究对此类器械在血液净化领域中的应用起到至关重要的作用。

由于在止血和血液因子及活性方面存在物种差异性，所以在体外试验中应尽可能首选人血。在我国，人血供应是受限制的，必须储备用于人体输血。而且血液保存期较短，这使得及时得到人血细胞更为困难。而我们日常检验工作中对大量血液的需求，使这种选择难以实现或不可能。有报道表明，家兔与人的红细胞具有相似的溶血特性，而家兔也是医疗器械生物学评价中常用的模式动物，并具有稳定的种系来源，使得家兔作为替代选择应用于血液相容性评价研究中具有极大地可行性。由于在血液反应方面存在物种差异性，GB/T 16886.4中指出要注意所选物种与人的生理差异和相近之处[3,5]，特别是凝血、血小板功能和纤维蛋白溶解以及对诸如麻醉剂、抗凝剂、溶血栓剂和抗血小板剂这类药物和抗生素的反应，由一种物种试验中得到的数据应予以谨慎说明。因此，在本研究中我们选择了最常用3类的血液净化器械，透析器，灌流器和体外循环管路，分别使用人血和兔血评价其血液相容性，对比两者在凝血，血栓形成，血小板活化，血液学和补体C3a激活的差异[2,7]，以探讨家兔应用在血液相容性评价中的可行性。

1.材料与方法

根据GB/T 16886.4/ISO 10993.4《医疗器械生物学评价 第4部分：与血液相互作用试验选择》和GB/T 16886.12/ISO10993.12《医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照样品》主要从以下试验项目对比人血和兔血血液相容性评价的差异：凝血酶原时间测定、体外血栓形成、血小板计数、补体激活试验、白细胞计数以及溶血试验[3,4,5,6]。

1.1 溶血试验

试验组：取3支试管，每管注入10mL 0.9%氯化钠注射液，按比例向每支试管内加入所需样品，摇匀，覆盖全部材料。

阴性对照组：取3支试管，每支注入同批号10mL 0.9%氯化钠注射液。

阳性对照组：取3支试管，每支注入10mL蒸馏水。

将试验管、阴性管、阳性管放入37°C水浴中保温30min，随后分别加入0.2mL稀释抗凝兔血，轻轻混匀，继续在37°C恒温水浴中保温60min。水浴结束后倒出管内液体，800g离心5min。取上清液置于紫外分光光度计比色皿中，在545nm处测量吸光度值，并计算各组3管的平均值。溶血程度按以下公式计算：

式中：A-供试品液吸光度；B-阴性对照液吸光度；C-阳性对照液吸光度。

1.2 白细胞计数试验

按比例将供试品加入到硅化玻璃管中，每组平行操作3个样品。每支硅化玻璃管中加入1.5mL血液，使材料全部被浸没，放入置于37°C隔水培养箱的旋转培养器上，30rd/min动态接触1h。1h后取出，吸出抗凝全血，用全自动血细胞分析仪测供试品、参照品和空白对照全血中的白细胞数量。

1.3 血小板计数试验

按比例将供试品加入到硅化玻璃管中，每组平行操作3个样品。每支硅化玻璃管中加入1.5mL血液，使材料全部被浸没，将硅化玻璃管放入置于37°C隔水培养箱的旋转培养器上，30rd/min动态接触1h。1h后取出供试品、参照品和空白对照管，吸出抗凝全血，用全自动血细胞分析仪测供试品、参照品和空白对照全血中的血小板数量。

1.4 凝血酶原时间（PT）试验

按比例将供试品加入到硅化玻璃管中，每组平行操作3个样品。每支硅化玻璃管中加入1.5mL血液，使材料全部被浸没，放入置于37°C隔水培养箱的旋转培养器上，30rd/min动态接触1h。用冷冻离心机，在4°C下，2000g离心10min，分离血浆，用凝血仪检测凝血酶原时间（PT）。

1.5 体外血栓形成试验

按比例将供试品加入到硅化玻璃管中，每组平行操作3个样品。试验方法：心脏采取家兔血液10mL，加入3.8%柠檬酸钠溶液0.4mL进行部分抗凝，向每支硅化玻璃试管内注入0.5mL部分抗凝血液，样品与对照管交叉注入，室温静止10～15min，待试管内形成部分血栓时，迅速加入肝素钠溶液，并摇晃试管使其充分抗凝。将试管放入到冷冻离心机内，2000g，4°C，离心10min，吸取上层血浆在凝血仪上检测剩余纤维蛋白原的含量（注：剩余纤维蛋白原含量越少则说明血栓形成量越多）。

1.6 补体C3a激活试验

按比例将供试品加入到硅化玻璃管中，每组平行操作3个样品。将供试品管、参照品管和空白对照管中分别加入等体积的血清，置于（37 ±1）°C水浴箱中孵育60min。孵育结束后，按照试剂盒说明书上的操作步骤进行检测。

2.结果与讨论

2.1 结果与分析

表1，表2分别为体外循环管路用兔血和人血试验的血液相容性试验结果。其中溶血试验结果表明，使用兔血和人血进行试验，溶血率均低于5%，且试验结果接近，表明体外循环管路溶血试验用人血和兔血具有良好一致性。从白细胞计数试验、血小板计数试验、凝血酶原时间试验和体外血栓形成试验这4个项目的结果分析，经过统计学SPSS计算，试验样品组与阴性对照品组的P值均大于0.05，且试验样品组与阴性对照品组均值的比值很接近，表明体外循环管路的这4个项目无论是用人血或兔血进行试验，血液相容性均表现良好。由于试剂盒和物种差异，人血和兔血检测补体C3a含量的结果差异较大，但试验样品组与阴性对照品组的P值均＞0.05，且试验样品组与阴性对照品组的比值接近，均具有良好的血液相容性。

表3，表4分别为聚砜膜透析器用兔血和人血试验的血液相容性试验结果。溶血试验结果表明，分别使用兔血和人血进行试验，溶血率均低于5%，且溶血结果一致，表明聚砜膜透析器溶血试验用人血和兔血具有良好的一致性。由于聚砜膜透析器吸附能力比较强，对白细胞和血小板都具有一定的吸附，特别是对血小板的吸附率比较高，所以这两个计数试验结果都比阴性对照或者空白的低。聚砜膜透析器的体外血栓形成试验，由于材料为纤维状态，在半凝固的血液中有一定的促凝作用，故纤维蛋白原含量均比阴性对照或空白对照低，凝血酶原时间有延迟。白细胞计数试验、血小板计数试验、凝血酶原时间试验和体外血栓形成试验这4个项目的结果分析表明，P值和试验样品组与阴性对照品组的比值都具有较好的一致性，因此，无论是用人血或兔血进行试验，聚砜膜透析器的血液相容性结果均可以取得比较好的一致性。由于试剂盒和物种的差异，人血和兔血补体C3a含量的值差异较大，但试验样品组与阴性对照品组的P值均大于0.05，且试验样品组与阴性对照品组的比值接近，两组血液结果一致。

表5，表6分别为血液灌流器用兔血和人血试验的血液相容性试验结果。其中溶血试验结果表明，兔血和人血溶血率均低于5%，由于兔的红细胞脆性比人红细胞差，对有一定溶血作用的材料，一般兔血的溶血率略大。但两组试验中，溶血率试验结果接近，表明血液灌流器溶血试验无论是用人血或兔血都具有良好的一致性。与透析器相似，血液灌流器吸附能力较强，对白细胞和血小板都具有一定的吸附，因此这两项试验结果均比阴性对照或者空白低。由于血液灌流器的材料为颗粒状态，在半凝固的血液中有一定的促凝作用，在体外血栓形成试验中，纤维蛋白原含量均比阴性对照或空白对照的值低，凝血酶原时间试验有延迟。从白细胞计数试验、血小板计数试验、凝血酶原时间试验和体外血栓形成试验这4个项目的结果分析，P值以及试验样品组与阴性对照品组均值的比值都比较一致。这表明在人血和兔血试验中，血液灌流器的血液相容性的结果具有较好的一致性。人血和兔血补体C3a的含量的结果值差异比较大，但试验样品组与阴性对照品组的P值均＞0.05，且试验样品组与阴性对照品组均值的比值很接近，结果一致。

2.2 讨论

表1. 兔血血液相容性试验结果（体外循环管路）

表2. 人血血液相容性试验结果（体外循环管路）

表3. 兔血血液相容性试验结果（聚砜膜透析器）

本研究选用血液相容性试验中3类常见医疗器械，体外循环管路、聚砜膜透析器和血液灌流器分析兔血和人血在血液相容性方面的差异，结果表明，在评价溶血率、白细胞计数、血小板计数、体外血栓形成和凝血酶原时间试验中均具有较好的一致性，且结果相近。在评价补体C3a激活试验中，由于试剂盒和物种的差异，人血和兔血补体C3a含量的值差异较大，但试验样品组与阴性对照品组的P值均大于0.05，且试验样品组与阴性对照品组的比值接近，两组血液结果一致。因此，在评价医疗器械产品血液相容性时，在没有足够可获得人血时，可考虑使用兔血替代。但对于补体激活试验只适宜用于相对试验结果分析（有参照样品），而不适宜用于绝对试验结果分析。

表4. 人血血液相容性试验结果（聚砜膜透析器）

表5.兔血血液相容性试验结果（血液灌流器）

表6. 人血血液相容性试验结果（血液灌流器）

[1] 杨立峰，柯军，颜林，徐红蕾.血液透析器的生物相容性研究及其临床应用现状. 临床医学工程. 2012, 19(2):320-322

[2] 许建霞，奚廷斐.血液透析器中空纤维的体外血液相容性评价.中国组织工程研究与临床康复, 2010. 14(38):7091-7094

[3] GB/T16886.4-2003 医疗器械生物学评价 第4部分：与血液相互作用试验选择

[4] GB/T 16886.12-2005 医疗器械生物学评价[12].第十二部分：样品制备与参照样品

[5] ISO 10993-4：2002 Biological evaluation of medical devices—Part 4: Selection of tests for interactions with blood

[6] ISO 10993-12：2009 Biological evaluation of medical devices—Part 12: Sample preparation and reference materials

[7] 王辉.血液灌流器滤芯中吸附树脂的体外血液相容性评价. 中国医疗器械杂志. 2013(6):444-446

Feasibility of Rabbits Blood Used in Medical Devices Blood Compatibility Evaluation

YANG Wen-run TIAN Sheng-hui KE Jun Guangdong Medical Devices Quality Surveillance and Test Institute (Guangzhou 510080)

Absract: Due to the restrictive of extensive use of human blood, we selected 3 commonly used blood purification medical equipments to investigate the feasibility of rabbit blood substitute human blood in the medical device blood compatibility evaluation. Results of two groups have a good consistency; rabbit blood can be an alternative to human blood in blood compatibility evaluation. Since the differences of rabbit blood and human blood, complement activation evaluation is only suitable for relatively test result analysis.

blood compatibility, rabbit blood, human blood, medical equipment

1006-6586(2016)07-0041-05

R319

A

2016-04-21

杨文润，助理工程师

广东省医疗产品生物安全评价科技服务平台（2012B011000003）