花生中促丝裂原蛋白活化激酶6a(AhMAPK6a)的克隆与表达分析

袁茂丽，张朝昕，藏旭阳，石书兵，张智猛，高文伟*

(1. 新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052； 2. 青岛市市容环境卫生管理中心，山东 青岛 266100； 3. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100)



花生中促丝裂原蛋白活化激酶6a(AhMAPK6a)的克隆与表达分析

袁茂丽1，张朝昕2，藏旭阳1，石书兵1，张智猛3，高文伟1*

(1. 新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052； 2. 青岛市市容环境卫生管理中心，山东 青岛 266100； 3. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100)

促丝裂原蛋白活化激酶(MAPK)是一类保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是一类植物对逆境胁迫反应途径中的关键家族基因。本研究利用已经构建的花生种子全长cDNA 文库，以拟南芥MAPK序列为模板，结合大规模EST测序和RACE克隆等方法，从花生中克隆得到了一个MAPK基因，命名为AhMAPK6a，并在GenBank上注册，注册号为KP329549。其cDNA序列全长1492bp，开放阅读框(ORF)含有1191bp，编码一条含有397个氨基酸的蛋白序列。不同物种中MAPK基因的氨基酸序列比对发现，该基因含有典型的Ser/Thr保守基序，与拟南芥、大豆、本生烟的同源性分别为86%、94%和90%。不同组织部位的荧光定量(qPCR)分析表明，该基因在叶片中的表达量最高，其次在根中，在茎、花、子叶和下胚轴中的表达量极低，表明该基因可能在花生的根和叶的生长发育中发挥较大作用。在脱落酸(ABA)和聚乙二醇(PEG)胁迫下，表达量发生明显变化，可以推测该基因在干旱胁迫反应中发挥重要作用。

促丝裂原蛋白活化激酶基因；花生；基因克隆；表达分析

促丝裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是一类保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，广泛存在于真核生物中。植物MAPK的研究开始于20世纪90年代初[1]，与动物和酵母中的MAPK序列相比，其含有11个保守的蛋白激酶亚区，在其Ⅶ和Ⅷ亚区之间的“T-Loop”结构中存在一个保守的TXY基序，该基序是ATP的磷酸化位点，是决定MAPK激酶活性的关键结构[2]。MAPKs是以三级激酶模式发挥作用的，即从促丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAPKKK/MAP3K/MEKK)磷酸化促丝裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK/MAP2K/MEK)再进一步磷酸化促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，被激活的组分去磷酸化后将信号传递给其下游的组分[3]。MAPK被激活后，有的停留在细胞质中激活其他蛋白激酶，有的进入细胞核激活特定转录因子引起功能基因的表达，最终都引起植物细胞对内外刺激的生理生化反应[4]。以往研究表明，植物MAPK与生长发育、活性氧、植物激素、低温、高盐、渗透胁迫、机械损伤、干旱以及病原物的侵染等各种反应相关联[5-12]。MAPK级联途径NtNPK1-NtMEK1-NtNTF6参与胞质分裂调控，调控有丝分裂后期赤道板上的运动过程[13]；YODA-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6级联信号通路调控表皮气孔的发育等[14]。本生烟NbNTF6在细胞分裂的后期被激活，而且可以在分生组织和幼嫩组织中检出[15]。

近年来，虽然植物MAPK级联途径的研究较动物和酵母要快，但植物MAPK级联途径的作用机制仍不够清楚，需要进一步分离鉴定MAPK家族新成员，完善MAPK级联途径模型。花生中MAPK基因分离的数量和功能研究很少，因此本研究通过同源比对从36741个花生Unigenes中找到了13个新的可能编码花生促丝裂原活化蛋白激酶的基因，对其中1个开放阅读框不完整的基因进行了全长克隆，将得到的完整序列进行初步分析和荧光定量分析，并向GenBank提交，旨在预测其可能参与的生物学途径。

1 材料与方法

1.1 试剂、材料

选用花生品种为花育19号。花生种子时期取子叶和下胚轴，幼苗四叶期取根、茎、叶，盛花期取花等组织样品各1g，迅速用液氮冷冻并保存于-80℃冰箱。花生种子于水中浸泡2h后播种于花盆中，覆膜后置于恒温培养箱中，25℃培养7d至发芽，生长到4叶期时用ABA(100μL)涂抹于花生叶片上，15%的PEG溶液直接灌根，处理后0、1、3、6、12、24、48、72h取样，液氮冷冻并保存于-80℃冰箱。

总RNA提取试剂盒、TOP10感受态、RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均购自天根生物科技公司，RACE试剂盒SMART RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司。凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司。pMD18-T载体和荧光定量试剂盒购自大连宝生物。

1.2MAPK基因的寻找

以拟南芥中的MAPK蛋白序列AtMAPK1 (GenBank: NP_181907.1)，利用Bioedit软件从花生cDNA文库(共计36741条EST序列)中搜索同源性较高的序列，作为备选基因。最终从已知的花生cDNA文库中找到了1个新的可能编码促丝裂原活化蛋白激酶的基因序列。但这个基因的序列是不完整的，需要通过3′，5′-RACE PCR扩增其完整序列。

1.3 RACE反转录

首先提取花生三叶期幼苗和各组织部位的总RNA，提取过程中用DNaseI消化DNA杂质。反转录方法参照Clontech说明书，将提取的RNA进行RACE反转录。

1.4 基因3′，5′端序列的扩增

以上一步得到的反转录产物为模板，进行5′和3′-RACE PCR。采用巢式PCR方法扩增。根据已知的基因序列分别设计两端的两条引物，首先用外围基因特异性引物AhMAPK6a-5-1和AhMAPK6a-3-1分别与通用引物UPM配对进行扩增，将扩增条带进行胶回收后作为第二轮PCR的模板，以内部引物AhMAPK6a-5-2和AhMAPK6a-3-2分别和UPM配对进行第二轮扩增。PCR反应总体系为25μL，其中包括：ddH2O 17.5μL、10缓冲buffer 2.5μL、通用引物UPM 2.5μL、花生MAPK基因引物0.5μL、dNTP 0.5μL、模板1.0μL，再加上聚合酶Polymerase 0.5μL。反应条件94℃，2min；94℃，30s；68℃，30s；72℃，40s；35个循环；72℃，5min。

1.5 设计的引物序列

(1)AhMAPK6a-5-1：5′-CGGCTGCTGGTGCTGC TGTTGATGGTCC-3′

AhMAPK6a-5-2：5′-CGTCGGACATGACAGCGT CAGG-3′

(2)AhMAPK6a-3-1：5′-GCACTGGCACACCCGT ACCTGACATCGC-3′

AhMAPK6a-3-2：5′-CCCCCTTCAACTTTGATTT TGAG-3′

(3)AhMAPK6a-F：5′-ATGGAAGGAGGAGCTG CC-3′

AhMAPK6a-R：5′-CTGATATTCAGGGTTAAAT GC-3′

(4)Actin-F：5′-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3′

Actin-R：5′-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3′

(5)AhMAPK6aF-Q：5′-TCTGTTGGTTGTATCT TCA-3′

AhMAPK6aR-Q：5′-ATAAGTAGACGCAGTTGAT-3′

1.6 序列分析

将所测得的序列利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的BLAST工具进行基因序列的相似性及同源性查找，并利用这些序列进行基因同源性的比较，cDNA全长序列ORF分析用DNAMAN软件进行ORF分析。

根据所测得基因的cDNA序列推导其氨基酸序列，并利用序列分析工具对其进行分析：采用DNAMAN软件进行同源序列分析，标记保守区域。选择GenBank中拟南芥的MAPK家族序列，利用DNAMAN软件进行系统进化树的建立，系统树采用Neighbour-Joining方法构建，进一步分析同源基因的进化特征。

1.7 荧光定量分析

选取花生不同组织部位：根、茎、叶、花、子叶和下胚轴进行该基因的组织表达特异性检测。选取不同处理后的叶片组织进行表达量检测。提取RNA，进行反转录成cDNA，根据ABI荧光定量测试仪器进行荧光定量检测。PCR反应总体系为20μL，其中包括：绿色荧光混合酶(SYBR Premix EX Taq)10 μL、ROX Reference Dye 0.4μL、两个引物各0.4μL 、模板2.0μL，再加上ddH2O 6.8μL。反应条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s；40个循环；95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s。

2 结果与分析

2.1 全长cDNA序列的获得

以拟南芥MAPK序列为模板，从花生幼苗cDNA文库中比对，获得一段类似MAPK基因的序列的中间片段1145bp，通过5′和3′-RACE PCR，获得5′端序列151bp，3′端序列261bp (见图1)。拼接cDNA序列全长为1492bp，其中编码区1194bp，非编码区298bp，编码一条含有397个氨基酸的蛋白序列。

2.2 氨基酸序列比对和系统进化分析

利用NCBI的BLAST对预测的氨基酸序列进行比对，发现该序列含有MAPK家族的特异性11个保守区域，而且在N段含有特异性的T-LOOP保守基序(图2)，因此该氨基酸序列应该为MAPK家族中一员。利用DNAMAN软件将拟南芥AtMAPK6：NP_181907.1，本生烟NbMAPK：BAG50821.1，大豆GmMAPK2：NP_001235426.1和花生中的AhMAPK6a的氨基酸序列进行比对分析。发现该序列含有典型的TEY保守基序，与拟南芥、大豆、本生烟的同源性分别为86%、94%和90% (图3)。

图1 获得的花生MAPK基因3′、5′片段和cDNA编码区的全长Fig. 1 Isolation of 3′, 5′ fragment and full length cDNA of ORF of AhMAPK6a注：M：DNA电泳marker DL2000 Note: M: marker DL2000

图2 4种植物MAPK氨基酸序列比对分析Fig. 2 Comparative analysis of the deduced protein sequence in 4 known plants MAPKs注：图中I到XI是MAPK氨基酸序列的11个保守区域，图中黑色方框内是保守基序TEY。Note: There were 11 conserved regions marked by I to XI. TEY domain was marked by black box.

进一步对该基因的序列和拟南芥的MAPK家族基因进行系统进化树的分析，发现该基因与拟南芥MAPK6的同源和进化关系最近，属于MAPK家族的A组分类(图3)，因此将该基因命名为AhMAPK6a，并在GenBank上注册，注册号：KP329549。利用DNAMAN软件将花生中的AhMAPK6a、本生烟NbMAPK：BAG50821.1、大豆GmMAPK2：NP_001235426.1的氨基酸序列与拟南芥MAPK家族序列进行聚类分析。

2.3 组织特异性表达分析

通过荧光定量PCR对该基因进行组织特异性表达分析，发现该基因在叶片和根系中的表达量最高，叶片中的表达量是花、子叶中表达量的9倍左右，在茎中的表达量较低，具有明显的组织表达特异性(图4)。可以推测该基因在花生叶片和根系生长过程中可能发挥较重要的作用，但在花生生殖生长中作用不明显。

图3 氨基酸序列的进化树分析Fig. 3 The phylogenetic relationships analysis of amino acid sequences注：图中黑色方框内是花生中的MAPK6a基因，A到D为MAPK家族的分类。Note: AhMAPK6a is marked by black box. A, B, C and D are the groups of MAPK family.

图4 花生AhMAPK6a基因在花生不同组织中的荧光定量分析Fig. 4 The qPCR analysis of AhMAPK6a in different tissues

2.4 非生物胁迫下的表达分析

图5可以看出，AhMAPK6a在ABA和PEG干旱诱导下的表达具有特异性。在ABA诱导的叶片中，该基因的表达量在处理1h时下降，但处理3h后表达量是对照的2倍，之后几小时该基因的表达量并没有明显变化。15%PEG处理后叶片中的表达量明显下降。表明该基因可能参与到植物非生物胁迫的应激反应，在ABA反应的途径中有一定作用，而在干旱胁迫条件下处于抑制状态。

图5 花生AhMAPK6a在ABA和PEG胁迫下叶片中基因表达分析Fig. 5 Expression analysis of AhMAPK6a under ABA and PEG stress注：图中A和B是花生叶片在ABA和PEG分别处理后，1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h的表达量变化图谱。Note: The expression patterns of AhMAPK6a induced by ABA and PEG at 1, 3, 6, 12, 24, 48, and 72 hours are shown in A and B, respectively.

3 讨论与结论

本试验克隆得到的序列特征属于MAPK家族，为新发现的MAPK成员，根据MAPK家族的结构特点以及序列分析可以将MAPK家族成员分为A、B、C、D四组，其中A、B、C三组含有TEY基序，D组含有TDY基序[16]。花生中MAPK6a序列中存在TEY基序，属于A组的MAPK，而且在植物中A组MAPK的研究也较为丰富，这与动物和酵母中的研究结果相符合[17]。

AhMAPK6a的组织特异性表达与拟南芥中的MAPK6相比有所差异。拟南芥中MPK6的缺失突变体降低了雄性能育性并使花粉发育异常，表明该基因在胚、花的发育中有重要功能[18]。而花生中的MAPK6a基因在叶片和根中的表达量很高，在花、子叶、下胚轴中表达量极低，可能该基因在花生生殖生长中并没有什么特殊作用，这与拟南芥中的研究结果有所不同。但也有研究表明，拟南芥MPK6在胚珠发育过程中促进了细胞分裂[19]，并且MPK6定位在有丝分裂的微管参与细胞分裂板调控和根的发育[20]，与花生中MAPK6a的在叶和根中表达量变化明显，也可能与叶和根的发育相关等一致。

在非生物胁迫下该基因的表达分析结果表明，其可能参与ABA介导的干旱过程，并在干旱调控中逆向调控。拟南芥中MAPK的激活促进了H2O2的产生，对ABA诱导的H2O2积累存在正反馈调节作用[21]，这与花生MAPK6a中ABA诱导下表达量上升的结果是一致的。而在干旱过程中，根系主要参与吸收及转运水分，叶片主要表现为气孔的关闭，阻止或减轻空气的蒸腾作用以保持水分。因此该基因在ABA和PEG的表达量负相关，可能是由于参与这些生理生化反应中的作用部位不同。

基于以上研究内容，下一步将构建AhMAPK基因的超表达载体，进行拟南芥的转基因研究以明确该基因的功能，为进一步阐明植物MAPK级联途径在胁迫反应中的信号转导机制和在生长发育中的作用奠定基础。

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Cloning and Expression Analysis of a Mitogen-activated Protein Kinase 6a Gene in Peanut

YUAN Mao-li1, ZHANG Chao-xin2, ZANG Xu-yang1, SHI Shu-bing1, ZHANG Zhi-meng3, GAO Wen-wei1*

(1.CollegeofAgriculture,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.QingdaoAppearanceandEnvironmentalSanitationCenter,Qingdao266100,China;3.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China)

Mitogen-activated protein kinases (MAPKKs) are encoded by a large family of serine/threonine/tyrosine protein kinases. MAPK cascades are key family which involved in plant stress response. Using the constructed full-length cDNA library of peanut (ArachishypogaeaL.) seed and using the AtMAPK as template, a new MAPK gene, designatedAhMAPK6awas isolated from peanut via a large number of sequences of expressed sequence tag (EST) and RACE clone. The sequence of the gene was submitted to GenBank and its GenBank ID was KP329549. The sequence ofAhMAPK6acDNA were 1492 bp, and ORF was 1191 bp. The number of deduced amino acid was 397. Alignment results of the amino acid sequences of MAPK gene in different species indicated that the gene contains typical Ser/Thr conserved motifs, and its homology withArabidopsis, soybean, andNicotianabenthamianais 86%, 94%和90%, respectively. Fluorescence quantitative PCR (qPCR) results for tissue expression analysis indicated that the expression ofAhMAPK6awas the highest in peanut leaves, and next in the roots. The expression level is very low in the stem, flower, cotyledon and hypocotyls. These results showed that the gene may play important role in the roots and leaves growth of the peanut. The expression significantly changed under ABA and PEG stress, so that it can be hypothesized that the gene plays an important role in peanut drought stress regulation.

mitogen-activated protein kinases; peanut (ArachishypogaeaL.); gene clone; sequence analysis

10.14001/j.issn.1002-4093.2016.03.001

2016-05-19

2014年国家“万人计划”青年拔尖人才；山东省自然基金三院联合基金(ZR2014YL011; ZR2014YL012)；山东省农业科学院青年科研基金项目(2016YQN14)；国家花生产业体系(CARS-14)；省农业良种工程重大课题子课题(2010LZ004-01)；山东省农业科学院青年英才培养计划

袁茂丽(1989-)，女，山东临沂人，新疆农业大学在读硕士，主要从事花生遗传育种研究。

*通讯作者：高文伟，教授，主要从事棉花遗传育种研究。E-mail: 280594606@qq.com

S565.2；Q785

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