花生果腐病病菌鉴定及生物学特性

张成玲，张田田，吴翠霞，路兴涛

(1. 山东省泰安市农业科学研究院，山东省除草剂新技术开发推广中心，山东 泰安 271000；2. 江苏徐州甘薯研究中心，江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏 徐州 221131)



花生果腐病病菌鉴定及生物学特性

张成玲1,2，张田田1，吴翠霞1，路兴涛1

(1. 山东省泰安市农业科学研究院，山东省除草剂新技术开发推广中心，山东 泰安 271000；2. 江苏徐州甘薯研究中心，江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏 徐州 221131)

花生果腐病是近几年花生上发生比较严重的一种病害，为明确山东泰安花生果腐病病原菌的生物学特性，有效开展病害防治和抗病育种工作，降低病害危害，采用组织及单孢分离法获得15个菌株，柯赫氏法则验证，8个菌株具有致病性。通过形态学鉴定8个菌株均为镰刀菌。利用不同pH、氮源、碳源处理研究了GK4菌株的生物学特点，结果表明，病原菌GK4产生两种类型分生孢子，大型孢子均为镰刀形，3～5个分隔，小型孢子长椭圆形至卵圆形，0～1个分隔，ITS构建系统进化树表明，该病原菌与GenBank 中 KP784419等茄病镰刀菌的序列一致率为100%，通过形态学和分子生物学鉴定该病原为茄病镰刀菌；该病菌生长的最适pH为8，最适宜氮源为牛肉膏和酵母膏，最适碳源为乳糖；菌丝致死温度为65℃ 5min。

花生；果腐病；镰刀菌；鉴定；生物学特性

花生是我国主要的油料作物和经济作物之一，在国民经济中占有重要地位，而花生病虫害的发生严重影响花生产量和品质[1-3]。花生果腐病，又称烂果病，世界范围内存在，主要为害花生荚果和果柄，造成荚果腐烂。在我国山东、河北、吉林、河南等地发生，危害严重[4-6]，尤其是重茬地块，有逐年加重趋势。国内外研究表明，花生果腐病由立枯丝核菌、镰刀菌等多种病原引起，不同地区或区域有不同的致病菌[4,5,7-10]。2012年以来，花生果腐病在山东泰安等地发生严重，不仅影响花生产量和品质，也影响农民种植积极性。本文针对山东泰安花生主产区该病害的发生，采用传统分类学和形态学手段，对病原菌进行了初步鉴定，同时对该病原菌生长影响条件及对不同碳源、氮源适应性进行了初步研究，为病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及分离纯化

从泰安市花生田采集到10株地下荚果呈黑色不规则病斑、地上部叶片脱落的花生样品。利用组织及单胞分离法分离病原菌，并通过柯赫氏法则验证。

1.2 菌体形态观察

将纯化的病原菌接种到PDA培养基平板上，25℃黑暗培养7d，观察菌丝生长及孢子形态[11]，利用十字交叉法测量菌丝生长直径。

1.3 菌丝致死温度测定

利用打孔器取5mm的菌丝块，放到盛有灭菌水的2mL离心管中，每管3枚菌块，置于恒温水浴锅中加热，设定45、50、55、60、65及68℃共6个温度处理，预热1min后开始计时，分别处理5min、10min后，取出菌丝块，25℃，PDA培养基上培养5d，观察菌丝是否生长，确定其致死温度。

1.4 pH值对菌丝生长的影响

无菌操作条件下用灭菌的1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液调节PDA培养基的酸碱度，使其pH值分别为5～12共8个处理，并制备相应pH值的PDA平板分别接种5mm菌饼，25℃、黑暗培养7d，每个处理4次重复，用十字交叉法测量菌丝直径。

1.5 氮源对菌丝生长的影响

以固体查彼克培养基为基础，用等量的硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵、草酸铵、硝酸铵、酵母膏、牛肉膏作为氮源，每处理3次重复。28℃培养5d，用十字交叉法测量菌丝直径。

1.6 碳源对菌丝生长的影响

以固体查彼克培养基为基础，用等量的麦芽糖、葡萄糖、乳糖、木糖、蔗糖、淀粉和果糖为碳源，每处理3次重复。28℃培养5d，用十字交叉法测量菌丝直径。

1.7 病原菌rDNA-ITS 的扩增及序列分析

将病原菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在 25℃、125 rpm·min-1条件下振荡培养3～5d，过滤收集菌丝体用于DNA提取。DNA 提取参照 Lee 等的方法[11]。利用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，GXL DNA Polymerase (TaKaRa Biotechnology (Dalian, China) Co., Ltd.)对病原菌的rDNA-ITS 区进行PCR 扩增。 扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 15s，55℃ 15s，68℃ 40s， 28个循环；最终68℃延伸 10min。 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在 GenBank 数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中进行 BLAST 比对分析，MEGA软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离纯化及形态特征

从发病花生果壳样品中，分离到15个分离物。单孢纯化后，利用菌丝和孢子悬浮液块接种到花生苗上，均未产生症状。但孢子悬浮液接种到花生荚果上，8株产生与田间相似症状，其中GK4致病性最强(图1)。从接种发病的花生病健交界处分离纯化病菌，经比较与原接种菌株在形态上相同，确认所分离到的分离物为发病植株的病原菌。

8株病菌菌丝在PDA培养基上为白色至米黄色，显微镜观察到8株病菌均产生两种不同分生孢子，大型分生孢子镰刀型，稍弯曲，3～5个隔膜；小型分生孢子长椭圆形至卵圆形，无隔或一个分隔(图2)。依据Leslie等[12]鉴定这几种病原菌均为镰刀菌(Fusariumspp.)。将致病性最强的GK4进行生物学及分子检测，结果表明，GK4 25℃在PDA培养基黑暗培养7d产生白色至淡黄色绒毛状菌丝，菌丝直径72μm左右。

图1 接种的带壳花生发病症状Fig.1 Symptoms of inoculated peanut pod rot

图2 病原菌的孢子形态特征Fig.2 Conidia morphology of pathogenic 注：A：GK4在PDA培养基上的大型孢子；B：GK4产生的小型孢子 Note: A: Macroconidia of the isolate GK4; B: Microconidia of the isolate GK4

2.2 菌丝致死温度测定

GK4在45、50、55和60 ℃分别处理5min、10min后，菌丝能继续生长，且生长速度不受温度和处理时间的影响，65℃处理5min不能继续生长；因此，其致死温度为65℃处理5min。

2.3 pH值对菌丝的影响

pH值对三种病原菌生长速度的影响一致，菌丝生长速度呈现逐渐变快，到达最适pH后继续提升，生长变慢。pH值8时，GK4生长最快，菌丝直径85μm，pH值12时生长最慢，菌丝直径50μm，而pH值9～11时菌丝生长无明显差异(图3)。

2.4 不同氮源和碳源对菌丝的影响

不同氮源对该病原菌菌丝生长的影响差异显著，最适宜的氮源是牛肉浸膏和酵母膏，菌丝直径均为62μm，其次是蛋白胨，菌丝直径58μm，硝酸钾和硝酸铵处理的菌丝直径分别为42μm 和27μm，硫酸铵和草酸铵作为氮源菌丝直径最小，分别为 17μm 和23μm，不适合该病原菌的生长，而对照的菌丝直径为57μm，但是菌丝相当稀薄，在生长范围内，培养基并未完全被菌丝覆盖，而其他氮素培养基上生长的菌丝，在生长范围内，培养基被菌丝完全覆盖，菌丝浓密(图4)。

图3 pH对GK4菌株菌丝生长的影响Fig.3 Effect of pH value on the mycelium growth of GK4

最适宜的碳源是乳糖，菌丝直径为71μm，其次是麦芽糖和蔗糖，菌丝直径均为66μm，葡萄糖和木糖处理的菌丝直径均为65μm，而果糖处理的菌丝直径最小，为64μm，碳源对菌丝生长影响相对较小，对照的菌丝直径为65μm，菌丝相当稀薄，在生长范围内，培养基并未完全被菌丝覆盖，而其他碳素培养基上生长的病原菌，在生长范围内，培养基被菌丝完全覆盖，菌丝浓密(图5)。

图4 不同氮源对菌株菌丝生长的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the mycelium growth of GK4

图5 不同碳源对病菌菌丝生长的影响Fig.5 Effect of different carbon sources on the mycelium growth of GK4

2.5 ITS序列测定分析

采用真菌通用引物ITS1/ITS4对该病原菌进行rDNA-ITS的PCR 扩增，电泳检测得到大小约500 bp 的片段，经测序分析该病原菌ITS序列片段全长 529 bp。将该病原菌的rDNA-ITS序列与在GenBank中相关真菌菌株的 ITS 序列进行比对分析，表明该病原菌序列与GenBank中KP784419等茄病镰刀菌的序列一致率为100%，构建系统进化树，聚为一簇(图6)，这一分析结果表明该病原菌属于茄病镰刀菌。综合上述形态学观察结果和ITS 序列同源性分析结果，确认该病原菌为茄病镰刀菌。

3 讨 论

根据病原菌的形态学特征分析结果得出，花生果腐病病原菌鉴定为镰刀菌。不同的氮磷钾施用水平不仅影响植物的经济指标，也可能影响病菌的侵染与繁殖。通过对分离到的优势病原菌GK4生物学特性研究表明，该病原菌在牛肉膏、酵母膏等培养基上生长繁殖迅速，可能与这几种培养基营养成分复杂、氨基酸含量高有关，因此可根据实验需要选择合适的氮源培养基。GK4在硫酸铵等为氮源的培养基上生长扩展比较缓慢，因此田间可施用此类氮源的肥料。不同碳源对菌丝生长的影响不大。

图6 根据GK4及Genbank中部分镰刀菌 rDNA-ITS序列利用邻接法构建系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of isolate GK4 and F.solani from genbank constructed on neighbor-joining analysis of the rDNA-ITS sequences

镰刀菌尤其是茄病镰刀菌在自然界中普遍存在，是多种植物及动物的致病菌[13-15]，能引起植物根腐、枯萎等症状，其产生的毒素不仅影响植物生长也影响植物品质[16]。报道表明，茄病镰刀菌是花生果腐病的病原之一[4-5]。而本研究的鉴定结果也表明，从泰安花生田采集到的花生果腐病主要是由该类病原菌引起，其镰刀菌ITS序列(加两端引物)为568bp，与山东报道的镰刀菌为不同的变种或亚种，与河北样品病原之一的ITS序列大小一致[4-5]。是否还有其他病菌与之混合侵染，需进一步采样分离鉴定。通过对该病菌的鉴定，尤其是对其系统的生物学特性研究，为该病害田间防治奠定了理论基础。

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Identification and Biological Characteristics of Fungal Isolates Causing Peanut Pod Rot Pathogen

ZHANG Cheng-ling1,2, ZHANG Tian-tian1, WU Cui-xia1, LU Xing-tao1

(1. Development and Promotion Centre of New Herbicide Technology of Shandong, Taian AcademyofAgriculturalSciences,Taian271000,China; 2.XuzhouSweetpotatoResearchCenter,XuzhouInstituteofAgricultureSciences,XuhuaiRegionofJiangsu,Xuzhou221131,China)

In order to carry out the work of disease prevention and disease resistance breeding, the morphology, biological characteristics and identification of the pathogen of peanut pod rot disease, a disease that occurred seriously in recent years, were determined. The pathogens were isolated with tissue and single spore isolation method, and the biological characteristics of GK4 was studied under different pH, nitrogen source and carbon source. The result showed that, 8 of 15 isolates were the pathogens and identified asFusariumspp. by morphology. Two kind of conidia were produced by the pathogen GK4. Macroconidia of the isolate GK4 is falcate, mostly 3～5 septates, and microconidia with 0～1 septate, is oval or ellipsoid shaped. The phylogenetic tree according to rDNA-ITS sequences showed that the homology rate of the GK4 sequence with KP784419 (F.solani) in Genbank was 100%. According to morphology and molecular biology, GK4 was identified asF.solani. The mycelium of the isolate grow best under pH 8, the most suitable nitrogen sources were beef extract and yeast extract, and the most suitable carbon source was lactose. The lethal temperature of the isolate was 65℃ for 5min.

peanut; pod rot disease;Fusariumsolani; identification; biological characteristics

10.14001/j.issn.1002-4093.2016.03.005

2016-06-21

山东省花生产业技术体系病虫害岗位资助；泰安市科技发展计划“花生病虫草害绿色防控技术集成与示范” (20113026)

张成玲(1983-)，女，山东沂源人，山东省泰安市农业科学研究院副研究员，博士，主要从事植物病虫害研究。E-mail: zhchling5291@163.com

S435.652; Q93-331

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