瘦素受体基因多态性与胃癌易感性研究*

武汉大学人民医院(武汉 430060) 凌 伟 于红刚 张海菊



·论著·基础研究·

瘦素受体基因多态性与胃癌易感性研究*

武汉大学人民医院(武汉 430060) 凌 伟 于红刚 张海菊

目的：探讨瘦素受体基因多态性与胃癌易感性的关系。方法： 随机选取89例胃癌患者作为研究对象，97例健康体检者作为正常对照，采用PCR-RFLP技术检测瘦素受体基因rs1137100 和 rs1137101位点的多态性，同时运用ELISA法测定血清瘦素水平。结果：胃癌组瘦素受体基因rs1137100位点的AA基因型和A等位基因明显降低罹患胃癌的风险(P=0.036, OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987;P=0.008, OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833)。rs1137101位点AA和GA基因型与胃癌发病风险无明显相关性。但是，位点rs1137101的A等位基因可能会降低胃癌的发病几率(P=0.006, OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802)。胃癌组血清瘦素水平明显高于正常对照组(P<0.05)。结论：瘦素受体基因多态性与胃癌易感性密切相关，瘦素受体基因rs1137100 和rs1137101的A等位基因可能会降低胃癌发病风险。

胃癌是常见高病死率及高发病率的恶性肿瘤。中国是胃癌高发区, 胃癌发病率居全球第二位[1]。最近,胃癌的发生有年轻化趋势,给家庭和社会带来沉重负担。然而迄今为止,胃癌的病因及发病机制仍不甚清楚。已有研究报道，在人的胃粘膜组织及胃癌细胞中均发现瘦素(Leptin)和瘦素受体(LEPR)表达[2]。研究发现，瘦素具有促进胃癌细胞增殖和分化作用[3]。本研究检测胃癌患者血清瘦素水平，同时采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术来检测瘦素受体基因rs1137100 及 rs1137101位点变异，探讨瘦素受体基因多态性与胃癌易感性关系，为胃癌的防治提供理论依据。

材料与方法

1 材 料

1.1 一般资料：病例来源于2013年3月至2014年9月在武汉大学人民医院就医的胃癌患者。胃癌患者符合如下条件：没有其他恶性肿瘤病史,无自身免疫性疾病, 并通过内镜形态和组织病理学检查无同时并发恶性肿瘤,血液采样之前未接受放疗和化疗。对照组的人群选择在同一时期在医院接受体检,并没有任何的消化系统疾病。随机选择了89例胃癌患者，与此同时,募集97例健康人作为对照组。两组一般情况无显著差异(P>0.05),具有可比性。

1.2 实验材料及仪器：瘦素ELISA试剂盒由康肽生物科技(北京)有限公司提供，人全血DNA提取试剂盒购自荷兰QIAGEN公司，反应引物应用Primer 5.0软件完成初步设计，再交给上海基康(GeneCore)生物技术有限公司合成，内切酶购自美国fermentas公司，PCR扩增仪为美国PE. Applied Biosystems公司产品，生化指标用日本OLYMPUSA U-1000全自动生化分析仪检测。

2 方 法

2.1 血清瘦素水平及血脂测定：抽取清晨空腹静脉血液检测血脂指标，同时留取2ml静脉血离心后取上清液，采用ELISA法测血清瘦素水平。

2.2 瘦素受体基因多态性检测：①DNA提取：取入组者外周血0.5ml,2% EDTA抗凝，用荷兰QIAGEN公司DNA试剂盒提取DNA。②LEPR引物设计：参照文献[4]， rs1137100位点引物序列为：正向: 5' - ACTTTTCTAACTTATCCAA - 3'；反向:5' - ATAAGTTAGAAAAGTGAGTA - 3'， rs1137101位点的引物序列为：正向:5' - AGGCAGTTTTCAGATGGTTC - 3'；反向:5' - GTGAACCATCTGAAAACTGC - 3'。③PCR扩增：PCR反应体系25 μl，其中样本DNA5.0 μl，正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，Tag DNA聚合酶0.3 μl，氯化镁(MgCl2)2.5 μl ，10倍缓冲溶液2.5 μl，4×dNTPs 0.5 μl ，无菌水13.4 μl。PCR扩增法：95℃预变性5min，95℃变性40s，，56℃退火30s，70℃延伸50s，30个循环，最后72℃延伸10min。④ RFLP分析：用Mspl酶消化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳分析酶切片段，紫外透视仪下观察帯型。rs1137100位点有三种基因型，分别为AA基因型(175 bp)，AG基因型(203 bp、175 bp)、GG基因型(203 bp)。rs1137101位点也包含三种基因型，分别是 AA基因型(416 bp)，AG基因型(416 bp、292 bp、124 bp)， GG基因型(292 bp、124 bp)。

结 果

1LEPR基因多态性结果 两组间基因型GG、AG、AA的观察值和预期值Hardy-Weinberg平衡吻合度良好(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示个体间无血缘关系。

2 胃癌组与健康对照组一般临床资料比较 两组的性别、年龄、血脂水平无显著差异(P>0.05)，胃癌组瘦素水平较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 两组瘦素受体基因型和等位基因频率的分布比较LEPRrs1137100位点基因型频率和等位基因频率在胃癌组和对照组之间分布有显著统计学意义(P<0.01)，见表1。rs1137100 、rs1137101中AA的基因型频率均明显低于对照组 (P<0.05)。rs1137100 和rs1137101多态性中的A等位基因与胃癌易感性存在显著关联(P<0.05)，可能会降低患胃癌的风险(OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833;OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802)。而且，rs1137100序列中的AA基因型能显著降低胃癌的易感性(OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987)。但是，rs1137101 序列中的AG、AA基因型和胃癌易感性没有明显关联，见表2。

表1 LEPR rs1137100基因型频率和等位基因分布频率

表2 LEPR rs1137101基因型频率和等位基因频率

4LEPR基因型对瘦素水平影响LEPRrs1137100 位点GG基因型携带者瘦素水平明显高于AA和AG基因型携带者(11.41±1.35vs8.27±2.13kg/m2, P<0.05 )，差异有统计学意义，rs1137101位点不同基因型携带者的瘦素水平差异无统计学意义(P>0.05 )。

讨 论

瘦素是肥胖基因编码的一种多靶器官、功能广泛的蛋白激素，其主要通过与LEPR结合来调节机体能量代谢及脂肪沉积。LEPR弥漫表达于各组织细胞中，其基因存在多种变异。在人的胃粘膜组织及胃癌细胞中研究已发现有瘦素和LEPR的表达[4]，这提示瘦素及其受体对胃癌发生可能起到重要作用。赵亮等[5]发现在胃腺癌细胞中可检测到LEPR异构体mRNA的表达。LEPR基因长度约5.1kb,可以编码1165个氨基酸[6]。在先前的报道中，LEPR基因中位点rs1137100(Lys109Arg、位于2号外显子)和位点rs1137101(Gln223Arg、位于4号外显子)的多态性是研究热点。他们都与许多疾病有关[7],包括胃癌。LEPR基因变异发生于受体编码胞外区第一个细胞因子域内，该变异导致配体及受体间的亲和力受到影响，从而改变了瘦素的生物学效应。有研究提出LEPR基因多态性导致胃癌发病的机制可能是：LEPR基因变异发生于胞内区,通过激活细胞外信号调节激酶-2和STAT等众多信号通路,从而诱导胃癌细胞增殖。韩国一项研究发现LEPR基因多态性与胃癌发生发展密切相关，国内应俊、任晓华等[8]研究也表明LEPR多态性会增加罹患胃癌风险。

本实验发现与对照组相比，胃癌组中rs1137100位点是AA基因型明显减少,表明AA基因型降低了胃癌发病的风险，而AG基因型和胃癌之间没有显著相关性。位点rs1137100的A等位基因会降低49.3%胃癌发病风险，这与韩国研究结果有所不同，他们认为基因型GA与基因型AA相比，罹患胃癌的风险会增加2.926倍。然而,另一个研究表明,G等位基因增加脊髓脊膜突出风险,这与我们结果相似。我们的结果还表明，虽然位点rs1137101的AA基因型在病例组中偏低,但与胃癌的发病风险无明显统计关联，然而位点rs1137101的A等位基因却可能会降低罹患胃癌风险。这个结果与那些认为位点rs1137101与胃癌发病风险无关的研究有所不同。另外，我们发现rs113710位点GG基因型胃癌患者瘦素水平明显高于AA和AG基因型，提示LEPRrs1137100位点多态性可能与胃癌患者体内高瘦素血症有关。推测其机制可能是，胃癌患者体内LEPRrs1137100变异，致使瘦素受体的结构和功能发生改变，诱发瘦素抵抗，进而引起高瘦素血症，高瘦素血症则通过细胞信号通路介导促进细胞增殖和血管增生，最终导致胃癌易感性增加。而rs1137101位点多态性则与瘦素水平无明显相关。

本次研究证实了瘦素受体基因位点rs1137100和rs1137101的多态性与胃癌易感性之间存在关联，并且发现位点rs1137100 和位点rs1137101的A等位基因都可能会降低胃癌发病风险。由于瘦素受体基因结构复杂、众多变异且因地域、人种不同而差异，加之各个研究方法的不同，最后导致研究结果迥异。并且，胃癌发生发展是极其复杂的过程，多因素参与其中，单个基因、位点的突变常仅仅作用于发病的某个环节，并不足以致病。因此对于瘦素受体基因多态性与胃癌易感性的关系，尚需扩大研究对象来源和样本量作进一步广泛而深入研究。

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[2] 王 颖，罗和生，赵 亮,等. 瘦素及其受体在胃癌中的表达[J].中华实验外科杂志，2005, 22: 609-610.

[3]SchnerderRBomsteinSRChrousosGPet al.Leptinmediatesaproliferativeresponseinhumangastricmucosacellswithfunctionalreceotor[J].HomMetabRes,2001, 33(1):1.

[4] 赵晓龙，朱兆华，黄开红，等.瘦素及瘦索受体在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达[J].中山大学学报(医学科学版), 2004 ,25 (3 ): 249-252.

[5] 赵 亮，沈志祥，沈 磊,等. 瘦素受体异构体ob-Ra和ob-Rb在胃腺癌组织中的表达[J].武汉大学学报，2008 ,29 ( 5 ): 626-630.

[6]MatsuokaN,OgawaY,HosodaK,et al .HumanleptinreceptorgeneinobeseJapanesesubjects:evidenceagainsteitherobesity-causingmutationsorassociationofsequencevariantswithobesity[J].Diabetologia,1997, 40: 1204-1210.

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(收稿：2016-06-19)

The relationship of leptin receptor gene polymorphisms with the susceptibility of gastric cancer

Ling Wei Yu Honggang Zhang Haiju

Renmin Hospial of Wuhan University(Wuhan 430060)

Objective:To analyze the relationship between the leptin receptor (LEPR) gene polymorphisms (rs1137100 and rs1137101) with gastric cancer (GC) susceptibility. Methods:Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was utilized to analyze the polymorphisms of rs1137100 and rs1137101 in 89 GC patients and 97 healthy controls. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detecte the leptin levels in blood. Results:AA genotype and A allele of LEPR rs1137100 were significantly decreased the GC risk (P=0.036, OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987;P=0.008, OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833). No obvious correlation have existed between LEPR rs1137101 AA and GA genotypes and the risk of GC. But, rs1137101 A allele might reduce the GC risk (P=0.006, OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802). The serum leptin level in GC group was higher than that in the controls (P<0.05). Conclusion :The leptin level and LEPR gene polymorphisms (rs1137100 and rs1137101) is highly correlated with susceptibility of GC,A allele of rs1137100 and A allele of rs1137101 might decrease the GC risk.

Stomach neoplasms Leptin @Gene polymorphism

*国家自然科学基金(81272693)

胃肿瘤 瘦素 @基因多态性

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.001